塞内卡病毒广东株分离鉴定及全基因组序列分析与VP1蛋白原核表达

论文摘要

塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是一种猪的新的外来的病毒,是小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属的典型代表。临床症状与猪口蹄疫（FMD）、猪水疱病（SVD）、猪水疱疹（VES）、猪水疱性口炎（VS）等水泡性疾病非常相似,容易与这些水疱性疾病相混淆、以及误诊,严重危害养猪健康,可以导致很大的经济损失。然而,SVA在致病机理、流行情况、诊断和防控技术等方面研究不多,鉴别技术较少,另外用于研究SVA病原的材料较少。SVA是如何传入中国境内、发生流行、如何遗传进化变异情况等需要深入的研究。因此,本研究开展SVA广东毒株的分离鉴定及其VP1基因的原核表达,具有现实意义。SVA广东毒株的分离鉴定试验。本研究采用三重荧光定量PCR方法,对本实验室于2016-2018年从广东地区多个猪场收集及保存的108份临床样品进行初筛,检测出2份疑似SVA的阳性样品。将2份疑似SVA阳性样品经无菌过滤处理后,接种猪睾丸细胞（ST）,仓鼠肾细胞（BHK-21）进行病毒分离,在第6代传代培养后,48h内能出现典型的细胞病变;连续传代培养后,取细胞培养上清液进行蔗糖密度梯度离心纯化,进行RT-PCR扩增及测序,将测序结提交到NCBI Blastn比对,结果表明两株病毒均为塞内卡病毒,分别命名为SVA CH-GDBL1-2016和SVA CH-GDBL2-2016。将细胞培养上清液作电镜检查,观察到直径约25nm大小的病毒粒子。经TCID50检测,其滴度分别为106.8、106.7。全基因组序列测定与分析比对试验。根据NCBI已登录的SVA序列,设计3对特异性引物,对2株SVA病毒进行全基因组扩增与分析,并利用NCBI Blastn网站、分析软件DNAStar,对病毒的全基因组序列作分析比对。结果表明:两株病毒与国内外分离毒株全基因的同源性在93.8%-99.3%之间。其中与美国分离株ATCC PTA-5343全基因组同源性最低,分别为93.9%、93.8%,与中国分离株CH/GXI09/2016的同源性最高,高达99.3%。而且,分离株SVA CH-GDBL1-2016与分离株SVA CH-GDBL2-2016之间的同源性为99.8%。在系统进化树中,本研究的2病毒株与美国分离株ATCC PTA-5343、SVV-001的亲缘性最远,变异较大,其中,SVV-001为SVA的经典原型;与中国华南地区2016年分离的毒株CH/GXI09/2016亲缘关系最接近。由此可见,本研究所分离鉴定的2株毒株属于Senecavirus病毒属。VP1基因的原核表达试验。为了建立SVA的间接ELISA检测试剂盒,本研究将分离株SVA CH-GDBL1-2016的VP1基因进行原核表达,并成功表达,获得大小约为48KDa的融合蛋白,经SDS-PAGE染色证实该蛋白为VP1蛋白;经Western Blot检测,VP1蛋白具有良好的抗原性。在多方条件的优化下,表达出效果较好的融合蛋白。为后续建立间接ELISA试剂盒,提供原材料。综上所述,本研究分离到Senecavirus病毒属SVA广东毒株2株,同源性分析表明,较美国、哥伦比亚、巴西、泰国的流行株,更接近中国流行株CH/GXI09/2016;成功获得SVA的VP1重组蛋白,有较好抗原性,拟用于建立ELISA诊断方法。为外来新病SVA的诊断、防控研究提供关键材料和奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 文献综述
•   1.1 塞内卡病毒的分类及致病性
•   1.2 SVA的分子学特征
•   1.3 SVA的流行病学
•   1.4 SVA的临床症状与病理特征
•   1.5 塞内卡病毒的诊断方法
•     1.5.1 病毒的细胞分离
•     1.5.2 酶联免疫吸附试验
•     1.5.3 中和反应
•     1.5.4 逆转录-聚合酶链式反应
•     1.5.5 荧光定量PCR
•   1.6 塞内卡病毒的免疫学反应
•   1.7 SVA的治疗与防控
•   1.8 本研究的目的与意义
• 2 SVA的分离与鉴定
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 病毒、细胞系
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 病毒RNA的提取
•     2.1.5 病毒的荧光定量PCR鉴定
•     2.1.6 细胞分离培养鉴定
•     2.1.7 病毒的纯化
•     2.1.8 病毒核酸RT-PCR检测
•     2.1.9 病毒粒子的电镜检查
•     2.1.10 病毒的TCID50 检测
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 病毒的荧光定量PCR鉴定结果
•     2.2.2 病毒的细胞分离培养结果
•     2.2.3 病毒核酸RT-PCR检测结果
•     2.2.4 NCBI Blastn比对结果
•     2.2.5 病毒的电子显微镜检查
•     2.2.6 病毒的TCID50 检测结果
•   2.3 讨论
• 3 SVA全基因组扩增及序列分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 毒株
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要试剂配制
•     3.1.4 主要仪器设备
•     3.1.5 引物的设计与合成
•     3.1.6 全基因组扩增
•     3.1.7 扩增产物的胶回收纯化
•     3.1.8 连接与转化
•     3.1.9 序列分析
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 SVA全基因组扩增结果
•     3.2.2 SVA全基因组序列分析
•     3.2.3 SVA核苷酸同源性分析
•     3.2.4 SVA全基因组系统进化分析
•     3.2.5 SVA部分基因突变比对分析
•   3.3 讨论
•     3.3.1 SVA全基因组扩增方法
•     3.3.2 SVA全基因组序列同源性分析
• 4 SVA VP1 基因的原核表达、鉴定及纯化
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 主要材料
•     4.1.2 主要仪器设备
•     4.1.3 主要试剂配制
•     4.1.4 构建克隆载体pMD-19T-VP
•     4.1.5 构建原核表达载体pET-32a-pMD-19T-VP
•     4.1.6 重组质粒pET-32a-pMD-19T-VP1 双酶切鉴定
•     4.1.7 VP1 重组蛋白的原核表达
•     4.1.8 VP1 重组蛋白的可溶性分析
•     4.1.9 VP1 重组蛋白表达条件的优化
•     4.1.10 VP1 重组蛋白的纯化
•     4.1.11 Western Blot鉴定
•     4.1.12 VP1 蛋白的浓度测定
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 VP1 基因的克隆结果
•     4.2.2 VP1 基因重组质粒的结果
•     4.2.3 重组质粒的双酶切鉴定
•     4.2.4 VP1 重组蛋白表达的结果
•     4.2.5 VP1 重组蛋白诱导时间的选择
•     4.2.6 VP1 重组蛋白诱导浓度的选择
•     4.2.7 VP1 重组蛋白的可溶性分析
•     4.2.8 VP1 重组蛋白纯化的结果
•     4.2.9 VP1 重组蛋白的Western Blot鉴定
•     4.2.10 VP1 蛋白浓度的测定
•   4.3 讨论
•     4.3.1 VP1 基因是重要的抗原蛋白
•     4.3.2 表达方式与表达载体的选择
•     4.3.3 VP1 蛋白的表达及纯化
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 进一步工作的方向
• 参考文献
• 致谢
• 项目资助
• 附录A
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 林秀银

导师: 魏文康,古飞霞

关键词: 塞内卡病毒,分离鉴定,序列分析,原核表达

来源: 仲恺农业工程学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 仲恺农业工程学院

基金: 动物疫病诊断团队建设,广东省农业科学院学科团队建设,201634TD,重大动物疫病监测点的建立及在规模化养殖中的应用,广东省农业农村厅,粤农计[2018]54号,畜禽重要疫病新型检测试剂盒的创制与产业化,广东省科学技术厅应用型科技研发专项资金项目,2016B020234006

分类号: S852.651

总页数: 84

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