丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白背层结构域抑制病毒进入的表征及优化

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是一种小型的单股正链带包膜的RNA病毒,系黄病毒科,丙型肝炎病毒属。HCV可通过血液传播,并在肝细胞中复制造成肝脏疾病,被称为丙肝。全世界范围内,大约有1.85亿人感染了丙肝病毒。虽然机体可以清除入侵的病毒颗粒,但是患者在最初感染HCV后通常伴随有慢性肝炎,有时还会恶化为肝硬化甚至肝癌。随着对丙肝病毒的结构及其生活史的深入了解,现已开发出直接抗病毒药物（DAAs）等,其可在体外有效抑制HCV感染。然而这些药物的使用仍然存在局限性,目前仍然迫切需要针对丙肝生活史的不同阶段制定出多重治疗策略。HCV复制周期的第一步就是吸附和侵入肝细胞,这为治疗提供了有效的靶点。HCV进入细胞的过程受细胞和病毒间的多种因素所调控,其中HCV E1和E2包膜糖蛋白会在病毒表面形成具有功能的异质二聚体。目前尚不清楚E1和/或E2中哪个是能够引导膜融合的蛋白。虽然E1在其中发挥的作用仍不明确,但现已知道E2能够结合细胞受体。对丙肝E2包膜糖蛋白的最新的研究表明,E2包膜糖蛋白的胞外域是呈球形的非延伸的折叠,并分为不同的两层:前层和中央基因型间结构域;和一个后层结构域（E2-Bld）。现已发现E1和E2-Bld之间的关键相互作用,为探究该相互作用在病毒进入细胞过程中扮演的重要角色,我们设计了E2-Bld多肽来抑制这种E1-E2-Bld相互作用。体外实验表明,可溶性E2-Bld多肽能抑制体外培养的活病毒（HCVcc）的复制和HCV假病毒（HCVpp）的进入,是研究HCV进入可靠的模型。有趣的是,这种E2-Bld多肽还能够抑制HCV在人源化肝脏小鼠体内的复制,人源化肝脏小鼠是研究HCV体内复制的有效模型,可以更全面地探究HCV的多样性。在此背景下,本项目旨在鉴定这种E2-Bld多肽的抑制作用。在最初的实验中,我们构建了一系列质粒来优化对E2-Bld多肽的纯化效果和功能发挥。通过改变多聚组氨酸标签的长度来增强纯化效果,通过突变半胱氨酸去除二硫键从而避免E2-Bld多聚化造成的功能破坏。这些质粒在哺乳动物细胞中能够表达E2-Bld多肽,但是表达效率不高。为提升产量,我们在第二步实验中,将E2-Bld多肽重新克隆并于昆虫细胞中表达。不幸的是,E2-Bld的产量并没有得到明显的提升。因此,为了不使用多肽免疫就能获得相应抗体,我们决定采取核酸免疫策略来避免蛋白纯化步骤。将已构建的各种质粒分别通过电转注射到小鼠的肌肉组织以表达E2-Bld多肽,然后收集这些小鼠血清并用HCV J6毒株开展抗原抗体中和实验。有趣的是,我们发现小鼠在不同的E2-Bld质粒免疫注射后产生了特异性免疫应答。总之,我们希望这些结果能有助于更好地了解HCV进入细胞的机制,并从长远来看,有望据此开发出抗HCV感染的疫苗。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1.Introduction
•   1.1.Hepatitis C virus,a global threat and burden
•   1.2.HCV genome and viral proteins
•   1.3.HCV life cycle
•   1.4.E1 and E2 envelope glycoproteins
•   1.5.Project overview
• 2.Materials and Methods
•   2.1.Plasmids construction
•     2.1.1.Constructs analysis and conception
•     2.1.2.Plasmids construction
•     2.1.3.Constructs amplification
•   2.2.Cell lines,reagents and biological materials
•     2.2.1.Protein analysis and purification
•     2.2.2.Transfection
•     2.2.3.Cell lysis
•     2.2.4.Trichloroacetic acid（TCA）acetone precipitation
•     2.2.5.Western blotting
•     2.2.6.Antibodies
•     2.2.7.Red Ponceau and Coomassie blue staining
•     2.2.8.Supernatant and protein collection
•     2.2.9.Imidazole gradient purification
•     2.2.10.Thrombin cleavage
•   2.3.Mouse immunization
•     2.3.1.Mice
•     2.3.2.Plasmid DNA immunization
•     2.3.3.Virus replication and stock preparation
•     2.3.4.Viral Titration
•     2.3.5.Neutralization test
• 3.Chapter Ⅰ- Mammalian cell expression approach
•   3.1.Plasmid construction strategies
•   3.2.phCMV H77 E2-Bld mutated cysteine6His-tagged plasmid
•   3.3.phCMV H77 E2-Bld9His tagged plasmid
•   3.4.Evaluation of the different E2-Bld expression in mammal cells
•   3.5.Mammalian cell stable expression strategy
•   3.6.Conclusion
• 4.Chapter Ⅱ- Insect cell expression approach
•   4.1.Plasmid construction strategies
•   4.2.pMT H77 E2-Bld6His tagged plasmid
•   4.3.pMT H77 E2-Bld GGG linker Thrombin cleavage6His tagged plasmid
•   4.4.Cell transfection and amplification
•   4.5.Protein purification
•   4.6.Thrombin cleavage
•   4.7.Conclusion
• 5.Chapter Ⅲ– in vivo expression approach using DNA mouse immunization
•   5.1.Viral titration
•   5.2.Mice immunization strategy
•   5.3.Neutralization assay
•   5.4.Conclusion
• References
• Annex
• Acknowledgements
• About the author

文章来源

类型: 硕士论文

作者: Emilie CARLOT

导师: Dimitri LAVILLETTE

关键词: 丙型肝炎病毒,包膜糖蛋白,后层结构域,抑制感染,组蛋白标签

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

分类号: R373.21

DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000020

总页数: 86

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