脂多糖广谱型核酸适配体的定向筛选、序列优化及分析应用

论文摘要

脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌细胞膜的固有组成成分,是对宿主具有一定生物毒性的非分泌性物质,所以又称内毒素（Endotoxin）。当细菌裂解或死亡,脂多糖便释放出来,若进入血液则能引起机体发热,产生一系列的炎症反应,是败血性休克、多器官功能障碍综合症等疾病发生的主要致病因子。脂多糖污染不可避免,常见于食品及饮用水、药品及医疗产品中,对人体健康产生巨大的威胁和危害。因此,筛选特异性的脂多糖识别分子和拮抗物质一直是人们关注的重点和研究热点。核酸适配体（Aptamer）因具有亲和力高、特异性强、易于修饰、体外合成方便、不需要动物实验等特点已成为近年来生物识别分子领域的研究热点,在安全检测、疾病治疗、生物分析等方面得到了广泛的应用。本研究采用Capture-SELEX技术并加以改进,以鼠伤寒沙门氏菌脂多糖为靶标筛选获得了一条广谱型脂多糖核酸适配体,然后对其序列结构进行剪裁优化,同时结合荧光偏振、圆二色谱、等温滴定微量热以及分子模拟等技术探讨了序列结构功能,分析了核酸适配体与脂多糖的结合机制,建立了快速、均相的检测方法并进行了细胞抗炎性能试验,为今后脂多糖的快速检测及拮抗分子的开发奠定了良好的基础。具体研究内容如下:首先,基于Capture-SELEX技术建立定向策略筛选获得了广谱型脂多糖核酸适配体。根据碱基互补配对原则设计了一条互补序列作为桥接序列,将ssDNA筛选文库固定在合成的磁性纳米颗粒上,然后将筛选靶标鼠伤寒沙门氏菌脂多糖与其孵育,这样有亲和力、特异性的ssDNA从磁珠上解离下来与靶标形成游离复合物,通过磁分离获得PCR模板进行扩增、酶切制备单链后进行下一轮循环,经过前6轮的正筛、反筛富集后,引入鼠伤寒沙门氏菌等活菌作为定向筛选物质,再经过9轮的正筛、反筛和定向筛交替筛选后,进行克隆测序以及亲和力、特异性试验,最终获得了一条能识别四种细菌来源脂多糖的广谱型核酸适配体EA7,其Kd值为102±17 nM。其次,为进一步验证EA7分子的识别性能,构建了Structure-switching型核酸适配体生物传感器,实现了脂多糖的均相检测。在5’端标记FAM荧光基团的EA7序列的上游设计了一条3’端带有DABCYL猝灭基团标记的短互补序列qCS,在没有靶标脂多糖存在的情况下,核酸适配体与qCS结合,使得FAM与DABCYL相互靠近发生荧光共振能量转移,荧光被猝灭;当靶标出现后,由于特异性亲和力作用,脂多糖取代qCS与EA7结合,而使EA7结构发生转变,从而互补链qCS从EA7上解离下来,FAM与DABCYL相互远离,荧光恢复,根据荧光变化可实现LPS的均相检测。在最优条件下,对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、肠炎沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖线性范围分别为:5-250 ng/mL、0.025-10?g/mL、0.05-5?g/mL、0.1-10?g/mL,最低检测限分别为3.0 ng/mL、21.30 ng/mL、47.70 ng/mL、99.31 ng/mL,饮用水加标回收率在95.1%-105.1%之间。该方法操作简便、无需分离、灵敏可靠。第三,对脂多糖广谱型核酸适配体EA7（为便于编号,重新命名为LA80）序列结构及功能进行了剪裁优化和分析。根据核酸适配体的一级序列和二级序列结构对全长核酸适配体LA80采用两种剪裁优化策略,共获得7条剪裁序列,然后构建了荧光偏振竞争法对其进行特异性分析以及利用ITC法进行亲和性分析,最终通过优化去除了部分多余的序列,确定长27 bp的核酸适配体LA27为最佳优化核酸适配体,它不仅保留了对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖等3种脂多糖的结合能力,其亲和力还提高了约1倍,解离常数Kd=46.2±9.5 nM。通过分析,我们认为LA27上5’端的CC和3’端CGA形成的开环状部分可能是脂多糖结合的支撑区,而其余碱基组成的茎环结构则可能是与脂多糖发生作用的主要结合区。圆二色谱CD结果进一步表明LA27可能以嵌入的方式与脂多糖结合。第四,建立了基于氧化石墨烯（GO）增强荧光偏振信号的分析方法快速检测脂多糖,以对LA27在分析检测方面的性能进一步进行分析。利用水浴超声法制备获得的氧化石墨烯纳米片吸附核酸适配体分子探针,形成GO/aptamer复合物,荧光偏振信号迅速增强,加入脂多糖后,分子探针从GO上解离下来与其结合形成LPS/aptamer复合物,荧光偏振信号降低,从而实现了脂多糖的快速、均相检测。结果表明,在最优条件下,LA27对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的检测限分别为38.7 ng/mL、88.7 ng/mL、154 ng/mL,比LA80作为分子探针的检测限分别提高了4.8、29和18倍;动力学试验结果表明该方法检测快速,可在30 min内完成检测。氯化钠注射液样品加标回收率在92%-112.5%之间。以上结果表明剪裁优化后的LA27由于序列更短、亲和力更好,使其检测效果更佳。第五,分析探讨了核酸适配体LA27的抗炎性能及其与LPS的结合位点和作用模式。以四种脂多糖分别诱导HepG2细胞使其产生炎症因子,利用ELISA法检测了空白组、LPS诱导组、LA27抑制组中TNF-?,IL-1?和IL-6等三种炎症因子的表达水平。结果发现,LA27抑制组中由鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖三种脂多糖分别刺激的细胞中TNF-?,IL-1?和IL-6炎症因子的表达水平显著降低（p<0.01）,而肠炎沙门氏菌脂多糖中表达的炎症因子水平无显著性差异（p<0.01）。这说明LA27具有一定的抗炎效果,且进一步验证了其对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的识别能力。利用MOE2018软件模拟分析发现,在疏水作用、氢键作用以及静电作用三种力的共同作用下,LPS可能通过类脂A上的脂肪酸链与由LA27上T3、T4、T6、T16、T17、T19、T20等7个胸腺嘧啶T碱基形成的疏水性大沟区域结合,形成了稳定的类似“T”型结构的复合物,从而特异性识别。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略符号说明
• 第一章 绪论
•   1.1 脂多糖
•     1.1.1 脂多糖的化学结构
•     1.1.2 脂多糖的危害
•     1.1.3 脂多糖的检测技术
•     1.1.4 脂多糖的拮抗剂研究进展
•   1.2 核酸适配体
•     1.2.1 核酸适配体的产生历史
•     1.2.2 核酸适配体的筛选技术
•     1.2.3 核酸适配体的序列优化工程
•     1.2.4 核酸适配体在食品安全检测方面的应用
•     1.2.5 核酸适配体在疾病治疗方面的应用
•   1.3 核酸适配体-靶标作用机制研究技术及进展
•     1.3.1 毛细管电泳-激光诱导偏振技术
•     1.3.2 原子力单分子测定技术
•     1.3.3 等温滴定微量热技术
•     1.3.4 圆二色谱技术
•     1.3.5 分子模拟
•   1.4 立题背景及意义
•   1.5 主要研究内容
• 第二章 基于Capture-SELEX技术定向筛选广谱型LPS核酸适配体
•   2.1 前言
•   2.2 试验材料与设备
•     2.2.1 主要试剂与材料
•     2.2.2 主要仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 亲和素化磁性纳米颗粒的制备
•     2.3.2 二元杂合筛选文库的制备
•     2.3.3 筛选文库的固定
•     2.3.4 基于Capture-SELEX的定向筛选
•     2.3.5 PCR扩增、纯化及单链文库制备
•     2.3.6 克隆测序及序列分析
•     2.3.7 候选核酸适配体亲和性分析
•     2.3.8 候选核酸适配体特异性分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 功能化磁性纳米颗粒的表征
•     2.4.2 ssDNA筛选文库的固定化
•     2.4.3 基于Capture-SELEX的定向筛选
•     2.4.4 候选适配体亲和性和特异性分析
•   2.5 本章小结
• 第三章 Structure-switching型脂多糖核酸适配体传感器研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 主要实验材料与试剂
•     3.2.2 主要实验仪器和设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 荧光猝灭效果的条件优化
•     3.3.2 荧光恢复效果的条件优化
•     3.3.3 实际样品分析应用
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 检测原理
•     3.4.2 荧光猝灭效果的条件优化
•     3.4.3 荧光恢复效果的条件优化
•     3.4.4 标准曲线的绘制
•     3.4.5 加标回收试验
•   3.5 本章小结
• 第四章 广谱型脂多糖核酸适配体序列优化与结构功能分析
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 主要实验材料与试剂
•     4.2.2 主要实验仪器和设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 氧化石墨烯纳米片的制备
•     4.3.2 核酸适配体剪裁原则
•     4.3.3 核酸适配体特异性试验
•     4.3.4 核酸适配体亲和性试验
•     4.3.5 圆二色谱分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 氧化石墨烯的表征
•     4.4.2 裁剪核酸适配体的特异性试验结果
•     4.4.3 剪裁核酸适配体的亲和力分析
•     4.4.4 核酸适配体LA80序列结构与功能分析
•     4.4.5 核酸适配体LA80和LA27结合脂多糖前后的圆二色谱结果
•   4.5 本章小结
• 第五章 基于剪裁核酸适配体及GO双信号增强的LPS荧光偏振快速检测方法研究
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料与设备
•     5.2.1 主要实验材料与试剂
•     5.2.2 主要实验仪器和设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 氧化石墨烯纳米片的制备
•     5.3.2 核酸适配体浓度的优化
•     5.3.3 氧化石墨烯浓度的优化
•     5.3.4 分析检测时间的优化
•     5.3.5 加标回收试验
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 检测原理
•     5.4.2 核酸适配体与氧化石墨烯浓度的优化
•     5.4.3 荧光法和荧光偏振法的动力学试验结果比较
•     5.4.4 分析检测时间的优化
•     5.4.5 LA27和LA80分别作为分子探针的检测结果比较
•     5.4.6 样品分析
•   5.5 本章小结
• 第六章 核酸适配体LA27的抗炎性能及其结合脂多糖的作用模式分析与探讨
•   6.1 前言
•   6.2 实验材料与设备
•     6.2.1 主要实验材料与试剂
•     6.2.2 主要实验仪器和设备
•   6.3 实验方法
•     6.3.1 细胞培养
•     6.3.2 脂多糖诱导和LA27抑制试验
•     6.3.3 细胞炎性因子的检测
•     6.3.4 分子模拟计算方法
•     6.3.5 数据处理与分析
•   6.4 结果与讨论
•     6.4.1 细胞炎性因子的检测原理
•     6.4.2 脂多糖处理时间对诱导HepG2 细胞产生炎症因子水平的影响
•     6.4.3 LA27核酸适配体抑制细胞炎性因子表达的效果
•     6.4.4 结合模式分析
•   6.5 本章小结
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 本论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 叶华

导师: 王周平

关键词: 脂多糖核酸适配体,定向筛选,剪裁优化,荧光偏振,分子模拟

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 江南大学

分类号: Q78;O657.3

总页数: 108

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