乳酸菌细菌素Durancin GL靶向抑制单增李斯特菌特性研究

论文摘要

从最初在食品保藏战略中的应用到最近提出的旨在抗击某些细菌感染的生物医学战略中的应用,细菌素受到越来越多的关注。单增李斯特菌是一种危害性非常严重的病原菌,由它引起的李斯特菌病致死率超过25%,而几乎所有的李斯特菌病都是由于食用了被污染的食物导致的。与大部分食源性致病菌相比,单增李斯特菌对人体的危害更大,因为其可耐受食品加工中的诸多恶劣条件（如低温、高压和低pH等）。近年来,世界各地爆发多起单增李斯特菌引起的中毒事件,使得李斯特菌成为了研究食品安全防控的热点。本课题组前期从乳制品（一种西班牙干酪）中分离出一株乳酸菌（Enterococcus durans 41D）,该菌产生一种抑制单增李斯特菌的新型生物活性肽（定名为乳酸菌细菌素Durancin GL）,本研究围绕乳酸菌细菌素Durancin GL及其靶向抑制单增李斯特菌特性开展研究,以期为开发高效天然食品防腐剂提供新选择,同时为深入明确乳酸菌细菌素的作用机制提供科学依据。主要研究结果如下:通过构建的乳酸菌细菌素Durancin GL重组大肠杆菌实现了该细菌素的高效制备,研究结果表明,外源表达的乳酸菌细菌素Durancin GL只有很少一部分存在于发酵上清液中,绝大部分产物积累于重组大肠杆菌细胞内。经细胞破壁、亲和纯化以及肠激酶切除多余序列后,制备的乳酸菌细菌素Durancin GL纯度高达98.07%。对乳酸菌细菌素Duranicn GL抑菌谱分析显示,该细菌素对李斯特菌具有靶向抑制作用。研究发现,乳酸菌细菌素Durancin GL热稳定性好,在较宽的pH范围内均具有抑菌活性,对蛋白酶K、木瓜蛋白酶和糜蛋白酶敏感,分子内二硫键与其抑菌活性有关。无论是在纯培养条件下还是冷鲜食品基质中,乳酸菌细菌素Durancin GL均可抑制单增李斯特菌的增长,其对单增李斯特菌L.monocytogenes Scott A的MIC为2.5±0.40mg/L。乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌的抑制效果与细菌素浓度相关,高浓度细菌素对单增李斯特菌的抑制效果可维持更长时间。乳酸菌细菌素Durancin GL作用单增李斯特菌时引起菌体细胞膜通透性的增加,细胞内物质（蛋白质、核酸等）释放,继而菌体的结构和形态发生改变,导致菌体细胞停止生长甚至死亡。乳酸菌细菌素Durancin GL分子量4.967 KDa（<10 KDa）,且N-端含有保守序列YYGNG,具有热稳定性,Durancin GL与单增李斯特菌细胞膜表面作用位点结合,引起细胞膜通透性增大,细胞内蛋白质、核酸等释放至细胞外,细胞的形态与结构菌发生改变这一作用机制,按照Klaenhammer等人修订的细菌素分类标准,乳酸菌细菌素Durancin GL应归为ClassⅡa细菌素。单增李斯特菌Man-PTS元件的外源表达研究。在大肠杆菌中,通过密码子优化基因序列,构建pET32a-ⅡC和pGS21a-ⅡD表达载体,成功表达Man-PTSⅡC与ⅡD元件。在真核哺乳动物细胞（293-6E、CHO-3E7）中,通过密码子优化,构建携带标签DYKDDDDK的表达载体pTT 5-ⅡC和pTT 5-ⅡD,分别用于293-6E和CHO-3E7细胞中实现表达。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western blot检测鉴定结果均表明表达的目的蛋白与预期相一致。基于基因同源重组原理,借助载体pHoss1实现了单增李斯特菌甘露糖磷酸转移酶系统（Man-PTS）中组分ⅡC和ⅡD基因的敲除。乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌Man-PTSⅡC和ⅡD缺失突变株的抑制活性的研究,揭示了单增李斯特菌Man-PTS膜蛋白元件ⅡC和ⅡD参与了细菌素对靶标菌的抑制作用。利用分裂泛素化酵母双杂交系统对乳酸菌细菌素Durancin GL与单增李斯特菌Man-PTS膜蛋白元件ⅡC和ⅡD进行分子互作研究,发现乳酸菌细菌素Durancin GL与单增李斯特菌Man-PTSⅡC存在分子间相互作用,与Man-PTS的另一组分ⅡD之间不存在分子间相互作用或该作用较弱。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩写符号说明
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 细菌素概述
•     1.2.1 细菌素定义
•     1.2.2 细菌素的制备
•     1.2.3 细菌素的性质
•     1.2.4 细菌素分类研究
•     1.2.5 细菌素抑菌机理研究
•   1.3 单增李斯特菌概述
•   1.4 乳酸菌细菌素Durancin GL
•   1.5 课题立题背景和意义
•   1.6 主要研究内容
• 第二章 乳酸菌细菌素Durancin GL性质及其制备
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 菌株、质粒、培养基及培养条件
•     2.2.2 试剂
•     2.2.3 仪器
•   2.3 方法
•     2.3.1 乳酸菌细菌素Durancin GL原核表达研究
•       2.3.1.1 乳酸菌细菌素Durancin GL表达载体的构建
•       2.3.1.2 乳酸菌细菌素Durancin GL重组菌的诱导表达
•       2.3.1.3 乳酸菌细菌素Durancin GL的分离纯化
•       2.3.1.4 SDS-PAGE与 Western Blot分析
•     2.3.2 乳酸菌细菌素Durancin GL抑菌谱分析
•     2.3.3 乳酸菌细菌素Durancin GL热稳定性
•     2.3.4 乳酸菌细菌素Durancin GL酸碱稳定性
•     2.3.5 乳酸菌细菌素Durancin GL蛋白酶敏感性
•     2.3.6 乳酸菌细菌素Durancin GL二硫键特性
•     2.3.7 数据处理与分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 乳酸菌细菌素Durancin GL原核表达研究
•       2.4.1.1 乳酸菌细菌素Durancin GL重组菌生长与细菌素积累
•       2.4.1.2 乳酸菌细菌素Durancin GL分离纯化
•       2.4.1.3 SDS-PAGE与 Western Blot分析
•     2.4.2 乳酸菌细菌素Durancin GL抑菌谱
•     2.4.3 乳酸菌细菌素Durancin GL热稳定性
•     2.4.4 乳酸菌细菌素Durancin GL酸碱稳定性
•     2.4.5 乳酸菌细菌素Durancin GL蛋白酶敏感性
•     2.4.6 乳酸菌细菌素Durancin GL二硫键特性
•   2.5 本章小结
• 第三章 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌抑菌活性研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 菌种及培养条件
•     3.2.2 试剂
•     3.2.3 仪器
•   3.3 方法
•     3.3.1 纯培养条件下乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌抑制效果
•       3.3.1.1 最小抑菌浓度
•       3.3.1.2 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌生长曲线的影响
•       3.3.1.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌碳源利用的影响
•     3.3.2 冷鲜食品中乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌抑制效果
•       3.3.2.1 乳酸菌细菌素Durancin GL保鲜液准备
•       3.3.2.2 单增李斯特菌菌悬液制备
•       3.3.2.3 冷鲜鸡肉处理及储藏试验
•       3.3.2.4 感官评定
•       3.3.2.5 pH测定
•       3.3.2.6 挥发性盐基氮（TVB-N）测定
•       3.3.2.7 单增李斯特菌生长曲线
•     3.3.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌作用方式研究
•       3.3.3.1 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌存活率的影响
•       3.3.3.2 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞外液电导率的影响
•       3.3.3.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞内物质释放的影响
•       3.3.3.4 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞形态与结构的影响
•     3.3.4 数据处理与分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 纯培养条件下乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌的抑制效果
•       3.4.1.1 最小抑菌浓度（MIC）
•       3.4.1.2 Durancin GL对单增李斯特菌生长曲线的影响。
•       3.4.1.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌碳源利用的影响
•     3.4.2 冷鲜食品中乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌抑制效果
•       3.4.2.1 感官评定
•       3.4.2.2 pH值变化
•       3.4.2.3 TVB-N含量
•       3.4.2.4 单增李斯特菌生长曲线
•     3.4.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌作用方式研究
•       3.4.3.1 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌存活状态的影响
•       3.4.3.2 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞外液电导率的影响
•       3.4.3.3 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞内物质释放的影响
•       3.4.3.4 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌细胞形态和结构的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 单增李斯特菌MAN-PTS元件的外源表达研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 菌种、细胞及质粒
•     4.2.2 试剂
•     4.2.3 仪器
•   4.3 方法
•     4.3.1 Man-PTSⅡC与ⅡD性质分析
•     4.3.2 原核系统外源表达
•       4.3.2.1 密码子优化、基因合成及表达载体克隆
•       4.3.2.2 表达载体转入表达菌
•       4.3.2.3 IPTG诱导表达
•       4.3.2.4 Western Blot检测
•     4.3.3 真核系统外源表达
•       4.3.3.1 密码子优化、基因合成及表达载体克隆
•       4.3.3.2 细胞培养和瞬时转染
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 Man-PTSⅡC与ⅡD性质分析
•     4.4.2 原核系统外源表达
•       4.4.2.1 重组质粒的验证
•       4.4.2.2 蛋白表达与Western blot检测
•     4.4.3 真核系统外源表达
•   4.5 本章小结
• 第五章 乳酸菌细菌素Durancin GL对单增李斯特菌MAN-PTS基因突变株抑菌活性研究
•   5.1 引言
•   5.2 材料
•     5.2.1 菌株、质粒、培养基及培养条件
•     5.2.2 试剂
•     5.2.3 主要仪器
•   5.3 方法
•     5.3.1 基因组DNA提取
•     5.3.2 同源臂序列验证
•       5.3.2.1 Man-PTSⅡD下游同源臂验证
•       5.3.2.2 Man-PTSⅡC上游同源臂序列验证
•       5.3.2.3 Man-PTSⅡC-ⅡD中间序列验证
•     5.3.3 敲除盒构建
•       5.3.3.1 Man-PTSⅡC敲除盒构建
•       5.3.3.2 Man-PTSⅡD敲除盒构建
•     5.3.4 敲除质粒验证
•     5.3.5 单增李斯特菌感受态细胞制备
•     5.3.6 重组单增李斯特菌构建
•     5.3.7 基因敲除单增李斯特菌特性
•       5.3.7.1 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株对细菌素Durancin GL敏感性
•       5.3.7.2 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株生长曲线
•       5.3.7.3 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株对碳源的利用情况
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 基因组DNA的提取
•     5.4.2 同源臂序列验证
•     5.4.3 敲除盒构建
•     5.4.4 敲除质粒验证
•     5.4.5 基因敲除单增李斯特菌特性
•       5.4.5.1 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株对细菌素Durancin GL敏感性
•       5.4.5.2 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株生长曲线
•       5.4.5.3 单增李斯特菌Man-PTS基因突变株对碳源的利用情况
•   5.5 本章小结
• 第六章 乳酸菌细菌素Durancin GL与单增李斯特菌MAN-PTS分子互作研究
•   6.1 引言
•   6.2 材料
•     6.2.1 菌种、质粒及培养基
•     6.2.2 试剂
•     6.2.3 仪器
•   6.3 方法
•     6.3.1 载体的构建
•       6.3.1.1 引物合成
•       6.3.1.2 目的基因扩增
•       6.3.1.3 载体构建
•       6.3.1.4 连接产物转化大肠杆菌Top10
•       6.3.1.5 质粒的鉴定
•     6.3.2 自激活检测、功能检测和相互作用检测
•       6.3.2.1 转入质粒
•       6.3.2.2 酵母转化反应
•       6.3.2.3 点板法检测蛋白的自激活、表达功能和相互作用
•       6.3.2.4 对ADE2、HIS3 报告基因检测
•       6.3.2.5 对LacZ报告基因检测
•     6.3.3 数据分析
•   6.4 结果与讨论
•     6.4.1 目的基因扩增
•     6.4.2 PCR扩增结果
•     6.4.3 对ADE2、HIS3 报告基因检测
•       6.4.3.1 自激活检测
•       6.4.3.2 表达功能检测
•       6.4.3.3 相互作用检测
•   6.5 本章小结
• 主要结论与展望
• 论文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录 :附图
• 附录 :作者在攻读博士学位期间研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 吴学友

导师: 陈正行

关键词: 乳酸菌细菌素,单增李斯特菌,靶向抑制,作用机制

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000048

总页数: 102

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