基于微流控技术的胎盘和脑类器官模型构建及应用

论文摘要

建立与人体生理高度相关的组织器官体外模型对于生命科学研究、组织器官重建、疾病研究和药物研发等具有重要意义。传统的动物模型和细胞模型难以反映人体组织器官特点以及对外界刺激的响应,因此迫切需要建立体外人源性模型新体系。本论文研究工作结合细胞生物学、干细胞和微流控技术,创新性地建立具有近生理特征的胎盘屏障和脑类器官体系,用以研究探索生命早期环境暴露对胎盘组织和脑发育的影响。分述如下:一、将干细胞自组装和微阵列芯片相结合,首次建立人诱导性多能干细胞(hiPSCs)来源的脑类器官芯片模型新体系,可高通量实现拟胚体的形成、神经外胚层的原位分化和脑类器官的发育,大大简化了传统脑类器官形成的方法。脑类器官再现了人类大脑发育初期的主要特征,包括细胞组分、大脑分区及脑皮层结构,为早期脑发育和神经系统疾病的研究提供了新思路和新平台。二、将干细胞自组装和微纤维生物材料相结合,建立了一种可负载脑类器官的水凝胶培养新体系。通过微流控多层同轴流体的精细操控,可控制备中空微纤维材料,并作为3D培养载体。该微纤维体系便于构建稳定的细胞微环境,为功能性类器官的高通量形成及初步应用提供了新思路。三、利用干细胞来源的微型脑类器官模型,用以研究探索生命早期酒精暴露对脑发育的影响。结果显示,酒精暴露可引起脑类器官的神经生长异常、兴奋性神经元与抑制性神经元比例失调以及神经元成熟的异常,同时转录组分析显示一系列与脑容量、颅面发育相关基因的表达异常,提示了酒精暴露与胎儿脑发育障碍密切相关。该研究为酒精暴露引起的异常脑发育的预防和诊疗提供了理论依据,为生命早期环境因素及其毒性评价提供了新策略和新方法。四、利用反向工程学原理,创新性地建立了包含多种细胞类型、组织界面以及流体因素的胎盘屏障模型,用以研究大肠杆菌感染对胎盘屏障的影响。该模型模拟了体内胎盘屏障的多种微环境因素和胎盘组织的功能。在大肠杆菌暴露条件下,胎盘组织呈现出一系列的炎症反应,包括绒毛膜滋养层细胞和内皮细胞炎症因子的分泌、细胞凋亡和单核细胞的粘附,提示了细菌感染与胎盘功能异常甚至胎儿炎症的相关。该研究对于更好地理解早产儿的发生机制,以及预防治疗具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 绪论
•   1.1 微流控技术简介
•   1.2 细胞分析
•   1.3 3D细胞培养
•   1.4 组织芯片
•     1.4.1 心脏芯片
•     1.4.2 肺芯片
•     1.4.3 肠芯片
•     1.4.4 肝芯片
•     1.4.5 肾芯片
•     1.4.6 血管芯片
•     1.4.7 神经芯片
•     1.4.8 软骨芯片
•     1.4.9 肿瘤芯片
•   1.5 总结
•   1.6 本论文研究目的及总体思路
• 2. 基于微阵列芯片的脑类器官模型构建体系
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 仪器与试剂
•     2.2.2 微阵列芯片制备及表征
•     2.2.3 hiPSC培养
•     2.2.4 脑类器官分化
•     2.2.5 实时定量PCR
•     2.2.6 样品制备及免疫荧光染色
•     2.2.7 统计和分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 基于微阵列芯片的拟胚体可控形成
•     2.3.2 hiPSCs原位自组装分化形成脑类器官
•     2.3.3 脑类器官的神经分化
•     2.3.4 脑类器官内不同脑区及脑皮层结构的鉴定
•   2.4 本章小结
• 3. 基于微纤维材料的脑类器官模型构建体系
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 仪器与试剂
•     3.2.2 微流控芯片设计与制备
•     3.2.3 微纤维材料制备
•     3.2.4 hiPSC培养
•     3.2.5 拟胚体形成
•     3.2.6 脑类器官分化
•     3.2.7 样品制备及免疫荧光染色
•     3.2.8 TUNEL分析
•     3.2.9 HE染色
•     3.2.10 实时定量PCR
•     3.2.11 钙离子成像
•     3.2.12 统计与分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 微纤维材料优化
•     3.3.2 基于微纤维材料的脑类器官分化
•     3.3.3 脑类器官的表征
•   3.4 本章小结
• 4. 生命早期酒精暴露对脑类器官分化的影响
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 仪器与试剂
•     4.2.2 hiPSC培养
•     4.2.3 拟胚体形成
•     4.2.4 脑类器官分化
•     4.2.5 脑类器官的酒精处理
•     4.2.6 脑类器官切片的酒精处理
•     4.2.7 神经细胞的酒精处理
•     4.2.8 样品制备及免疫荧光染色
•     4.2.9 TUNEL分析
•     4.2.10 实时定量PCR
•     4.2.11 神经突生长检测
•     4.2.12 RNA-seq及分析方法
•     4.2.13 统计与分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 脑类器官表征
•     4.3.2 酒精暴露对神经元分化的毒性评价
•     4.3.3 转录组水平分析酒精暴露对脑类器官的影响
•     4.3.4 酒精暴露对神经突生长的毒性评价
•     4.3.5 酒精暴露对神经成熟的毒性评价
•   4.4 本章小结
• 5. 胎盘屏障模型体系构建及应用
•   5.1 引言
•   5.2 实验部分
•     5.2.1 仪器与试剂
•     5.2.2 细胞培养
•     5.2.3 多层夹膜芯片的设计与制备
•     5.2.4 芯片细胞共培养
•     5.2.5 单核细胞的活化实验
•     5.2.6 细胞膜染色
•     5.2.7 大肠杆菌感染
•     5.2.8 实时定量PCR
•     5.2.9 免疫荧光染色
•     5.2.10 微绒毛结构表征
•     5.2.11 细胞死活鉴定
•     5.2.12 统计与分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 胎盘屏障芯片模型体系的建立
•     5.3.2 胎盘屏障极性结构的形成及评价
•     5.3.3 大肠杆菌感染引起胎盘滋养层细胞炎症反应
•     5.3.4 大肠杆菌感染引起巨噬细胞激活
•     5.3.5 大肠杆菌感染引起胎盘内皮细胞的炎症反应
•   5.4 本章小结
• 6. 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点
•   6.3 展望
• 参考文献
• 附录A 论文所述溶液和试剂配制
• 附录B 文中所用缩略语
• 攻读博士学位期间科研项目及科研成果
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱玉娟

导师: 秦建华,袁景利

关键词: 器官芯片,微流控技术,脑类器官,胎盘屏障,环境毒性评价

来源: 大连理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 大连理工大学

分类号: R318

DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2019.003473

总页数: 142

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