猪伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主相互作用WW-domain蛋白的筛选

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染引起的一种猪烈性传染病。猪是其唯一自然宿主及主要传染源。感染后可导致妊娠母猪流产、产死胎及木乃伊胎,公猪不育和育肥猪呼吸系统症状。初生仔猪主要表现为神经系统症状,病死率高达100%,但目前还没有特效药物治疗,主要以疫苗预防为主。2011年以来,中国很多猪场相继发病,给养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明我国流行的PRV毒株为基因II型变异株,Bartha-K61弱毒疫苗免疫不能对其起到防控作用。PRV UL56蛋白（pUL56）属于II型膜蛋白,研究发现pUL56可促进PRV在神经元之间的传播,且对病毒的毒力有一定的影响。本研究以pUL56为研究对象,筛选与其互作的含有WW结构域（domain）的宿主蛋白。通过免疫共沉淀（Co-immuoprecipiated,Co-IP）实验确定了与pUL56相互作用的WW-domain宿主蛋白:Bcl-2相关永生基因3（Bcl-2 associated athanogene 3,BAG3）蛋白、神经前体细胞表达发育下调蛋白4（Neural precursor cell expressed developmentally down regulated 4,Nedd4）和ITCH。利用激光共聚焦实验确定了表达带有绿色荧光蛋白（GFP）的GFP-pUL56与HA-mBAG3、HA-mNedd4及HA-sITCH在转染的HEK293T细胞高尔基体上存在共定位。通过互作,GFP-pUL56可将细胞质分布的HA-mBAG3、HA-mNedd4及HA-sITCH重新定位于高尔基体。前期研究已证实多种病毒蛋白可通过其编码的PPXY基序（PY motif）与含有WW-domain的宿主蛋白产生互作。为验证pUL56与宿主蛋白的互作是否通过PY motif发挥作用,本研究将pUL56截短表达为N末端、中间区域（包含全部PY motif）及C末端。分段Co-IP实验结果证明BAG3、Nedd4和ITCH主要与pUL56中间区域互作。此外,pUL56 C末端与Nedd4也存在互作。本研究将pUL56编码的4个PY motif突变为AAXY。Co-IP实验结果表明随着PY motif突变的增加,pUL56与宿主蛋白互作能力逐渐减弱,其中pUL56 PY motif全部突变后与BAG3和ITCH完全失去互作能力,而与Nedd4仍存在微弱的互作;激光共聚焦实验结果表明PY motif全部突变后,Nedd4和ITCH与pUL56在细胞内仅存在微弱的共定位信号。此外,pUL56可介导宿主蛋白BAG3、Nedd4和ITCH表达下调。其中,pUL56 PY motif在Nedd4及ITCH的下调过程中发挥作用,而对BAG3的下调无作用。因此,pUL56介导的BAG3下调存在其他分子机制。综上,本研究阐明了PRV pUL56与宿主蛋白BAG3、Nedd4及ITCH之间存在相互作用及其互作的分子机制。并且,pUL56可显著下调WW-domain宿主蛋白的表达,为揭示PRV pUL56的毒力表型奠定了分子基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   1.1 猪伪狂犬病
•   1.2 WW-domain蛋白概述
•   1.3 研究的目的与意义
• 第二篇 研究内容
•   第一章 PRV UL56 蛋白与WW-domain宿主蛋白相互作用的鉴定
•     1.1 材料
•     1.2 方法
•     1.3 结果
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第二章 UL56 蛋白与宿主蛋白相互作用的分子机制
•     2.1 材料
•     2.2 方法
•     2.3 结果
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 UL56 蛋白对宿主蛋白表达的影响
•     3.1 材料
•     3.2 方法
•     3.3 结果
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略表
• 附录
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王书文

导师: 蔡雪辉

关键词: 伪狂犬病病毒,蛋白,宿主蛋白,相互作用

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

基金: 黑龙江省自然科学基金留学归国人员项目(LC2018017),中国博士后科学基金第61批面上项目(2017M611075)

分类号: S852.651

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000131

总页数: 53

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