TolC介导ExPEC生物被膜形成对高渗环境耐受性的机制研究

论文摘要

生物被膜是细菌黏附聚集到有生命或无生命基质表面而产生的一种抗逆境生存策略,也是细菌多重耐药性、免疫逃避、慢性感染和持续性感染的主要原因。高渗环境常常用于肉品加工贮藏,可有效抑制病原菌生长繁殖及生物被膜形成。因此,加强高渗环境在抑菌及控制清除生物被膜方面的研究具有重要意义。肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一种重要的食源性人兽共患性病原菌,可污染食品和水源导致人和动物疾病的发生,对畜牧业发展和公共卫生均可造成严重威胁。外膜蛋白Tol C是革兰氏阴性菌中多种不同家族外排泵的主要组成成分,本实验室前期研究证明tol C缺失可降低Ex PEC对高渗环境的耐受性,且通过激活Cpx AR双组分系统影响Curli菌毛形成,进而影响生物被膜的形成,但其作用机制尚不清楚。RNA-Seq研究表明高渗环境下,tol C基因缺失可导致与高渗响应有关的外膜蛋白Omp W表达显著上调。因此,本研究从Tol C依赖性外排泵及外膜蛋白Omp W两个角度开展研究,探讨Tol C介导Ex PEC生物被膜形成对高渗环境耐受性的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.外排泵抑制剂CCCP对Ex PEC生物被膜形成的影响分别在1/2M9、1/2M9+0.8%蔗糖、1/2M9+0.06mol/L NaCl三种培养基中添加不同亚抑菌浓度的外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP）,检测Ex PEC PPECC42株在相应培养基上的生长特性和生物被膜形成能力。结果表明:亚抑菌浓度的CCCP可抑制Ex PEC生物被膜形成,但同时也抑制了菌株的生长。2.Tol C依赖性外排泵在Ex PEC高渗环境下生物被膜形成中的作用研究以ExPEC PPECC42为亲本株,针对大肠杆菌10个TolC依赖性外排泵的伴侣蛋白基因（mac B,acr B,emr Y,mdt C,mdt B,acr D,mdt E,emr B,mdt F和acr F）分别构建缺失株,研究相关基因对Ex PEC响应高渗应激时生物被膜形成、Curli菌毛合成的影响及对菌株生长特性和耐药性的影响,分析Tol C依赖性外排泵系统在Ex PEC高渗环境下生物被膜形成中的作用。结果表明:（1）外排泵基因的缺失不影响菌株在三种培养基中的生长特性;（2）菌株对红霉素、四环素、环丙沙星、氯霉素和利福平的耐药性与特定的Tol C依赖性外排泵有关;（3）△tol C菌株对高渗环境耐受性降低,在高渗环境下生物被膜形成能力下降,与部分Tol C依赖性外排泵功能受损有关。3.外膜蛋白OmpW在Ex PEC高渗环境下生物被膜形成中的作用研究以ExPEC PPECC 42株和△tol C株为亲本株,构建△ompW、△tol C△ompW及WT::omp W菌株,研究高渗环境下其生长特性、生物被膜形成能力和Curli菌毛合成能力等。结果显示:omp W基因缺失对菌株生长和生物被膜形成均不造成影响,但在Na Cl高渗环境下过表达omp W和缺失tol C均可造成Ex PEC生物被膜形成能力显著降低,而且csg B表达量下调,cpx P上调,鉴于RNA-seq和RT-q PCR均显示△tol C中omp W表达量上调,推测Na Cl高渗环境下△tol C可通过上调omp W表达以响应高渗应激,激活Cpx AR双组分系统,进而抑制细菌Curli菌毛和生物被膜形成;在蔗糖高渗环境下omp W过表达并不影响Ex PEC生物被膜的形成,提示△tol C对蔗糖高渗环境的响应性降低涉及其他机制。总之,部分Tol C依赖性外排泵基因缺失可降低生物被膜形成能力及对高渗环境的耐受性;omp W基因过表达可通过调控Cpx AR双组分系统影响Curli菌毛合成,降低Ex EPC生物被膜形成对高Na Cl环境的耐受性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（ABBREVIATION）
• 1 前言
•   1.1 肠外致病性大肠杆菌研究进展
•     1.1.1 肠外致病性大肠杆菌的概述
•     1.1.2 肠外致病性大肠杆菌的致病机理
•     1.1.3 肠外致病性大肠杆菌的耐药现状
•     1.1.4 肠外致病性大肠杆菌的人兽共患风险
•   1.2 细菌生物被膜研究进展
•     1.2.1 细菌生物被膜的概述
•     1.2.2 细菌生物被膜的危害
•     1.2.3 大肠杆菌生物被膜的形成过程及调控组分
•     1.2.4 生物被膜的控制与清除
•   1.3 TolC蛋白研究进展
•     1.3.1 TolC蛋白及功能
•     1.3.2 TolC依赖性外排泵功能介绍
•     1.3.3 TolC与细菌生物被膜
•   1.4 外膜孔蛋白OmpW及功能介绍
•   1.5 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要试剂及仪器设备
•     2.1.3 主要培养基和试剂的配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 菌株的构建
•     2.2.2 试验菌株菌株生长曲线测定
•     2.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定
•     2.2.4 生物被膜形成能力评价
•     2.2.5 高渗应激对生物被膜形成能力的影响
•     2.2.6 Curli合成能力的评价
•     2.2.7 RT-qPCR验证高渗条件下被膜菌相关基因的表达量
•     2.2.8 数据分析
• 3 结果与分析
•   3.1 外排泵抑制剂的作用研究
•     3.1.1 CCCP对 ExPEC生物被膜形成的影响
•     3.1.2 CCCP对 ExPEC生长曲线的测定
•   3.2 TolC依赖性外排泵的作用研究
•     3.2.1 基因缺失株的构建
•     3.2.2 生长曲线的测定
•     3.2.3 MIC的测定
•     3.2.4 生物被膜形成能力的测定
•     3.2.5 高渗应激对生物被膜形成的影响
•     3.2.6 Curli合成能力分析
•   3.3 外膜蛋白OmpW的作用研究
•     3.3.1 菌株的构建
•     3.3.2 生长曲线的测定
•     3.3.3 生物被膜形成能力测定
•     3.3.4 高渗应激对生物被膜形成的影响
•     3.3.5 Curli合成能力分析
• 4 讨论
•   4.1 TolC依赖性外排泵参与高渗应激条件下生物被膜的形成
•   4.2 OmpW与 Tol C调控高渗应激条件下生物被膜的联系
•   4.3 细菌生物被膜的防控
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 崔爱莲

导师: 栗绍文

关键词: 生物被膜,高渗,外排泵

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

基金: 国家自然科学基金(31572539)项目

分类号: S852.61

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000287

总页数: 68

文件大小: 3474K

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