一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法论文和设计-殷焕顺

全文摘要

本发明公开了一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5‑羟甲基胞嘧啶的方法，本发明首先构建了检测5hmC的光电化学生物传感器，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO2、探针DNA、5hmC、对氨基苯硼酸、PAMAM和氨基修饰的氧化锌。本发明利用黑色TiO2的光电性能、糖基转移酶对5‑羟甲基胞嘧啶的专一性催化、PAMAM信号扩增作用以及ZnO的信号猝灭，实现对5‑羟甲基胞嘧啶的灵敏检测。本发明的检测方法操作简单，便于实现小型化，仅对ITO电极表面进行修饰就可以实现对5‑羟甲基胞嘧啶的检测。

主设计要求

1.一种检测5hmC的光电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO2、探针DNA、含有5hmC的互补DNA链、氨基苯硼酸、PAMAM和氨基修饰的氧化锌；所述探针DNA与所述互补DNA链的碱基互补；所述探针DNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，探针DNA的3′端修饰有磷酸基团；所述含有5hmC的互补DNA链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

设计方案

1.一种检测5hmC的光电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO_{2<\/sub>、探针DNA、含有5hmC的互补DNA链、氨基苯硼酸、PAMAM和氨基修饰的氧化锌；}

所述探针DNA与所述互补DNA链的碱基互补；

所述探针DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，探针DNA的3′端修饰有磷酸基团；

所述含有5hmC的互补DNA链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的光电化学生物传感器，其特征在于，所述电极为ITO电极。

3.权利要求1或2所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将电极进行预处理；

(2)将黑色TiO_{2<\/sub>固定在步骤(1)处理后的电极表面；}

(3)将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面；

(4)将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面；

(5)在糖基转移酶的催化作用下，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面；

(6)利用邻二羟基与氨基苯硼酸的反应，将对氨基苯硼酸修饰到步骤(5)处理后的电极表面；

(7)利用氨基与羧基的反应，将PAMAM修饰到步骤(6)处理后的电极表面；

(8)利用氨基与羧基的反应，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面，即得到制备的生物传感器。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗30-60min，晾干。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:4。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将黑色TiO_{2<\/sub>固定到预处理后的电极表面的方法为：}

将黑色TiO_{2<\/sub>加入到去离子水中，超声分散，制成黑色TiO_{2<\/sub>分散液，将黑色TiO_{2<\/sub>分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥；}}}

所述黑色TiO_{2<\/sub>与去离子水加入量的比为(10-20)mg:(3-10)mL；}

所述黑色TiO_{2<\/sub>由如下方法制备而成：}

将白色TiO_{2<\/sub>和硼氢化钠按重量比为(0.5-2)：(0.5-2)研磨混匀，200-400℃氮气氛围下煅烧0.5-2h，得到黑色固体，洗涤、干燥，即得黑色TiO_2<\/sub>。}

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，超声分散的时间为1-3h。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面的方法为：

将包含DNA探针的探针固定液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；

所述探针固定液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M NaCl、1-5mM TCEP；pH6.0-8.5。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：

将10-40μL包含5hmC的DNA杂交液滴加到步骤(4)处理后的ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-4h；

所述DNA杂交液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M NaCl；pH 6.0-8.5。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面的方法为：

将包含糖基转移酶的糖基转移酶反应液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；

所述糖基转移酶反应液中含有：3-15mM Tris-HCl、10-100mM NaCl、5-20mM Mg Cl _{2<\/sub>、0.5-4mM DTT；pH 6.0-8.5。}

11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面的方法为：

将修饰氨基的ZnO分散液滴加到步骤(7)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；

所述修饰氨基的ZnO由如下方法制备而成：

将醋酸锌加入到无水乙醇中，搅拌均匀，在搅拌条件下加入NaOH溶液，于120-180℃条件下反应4-8h，得到第一产物；

将第一产物洗涤，然后加入到NaOH溶液中，60-90℃搅拌回流反应15-25h，得到第二产物；

将第二产物洗涤，然后加入到乙醇-水混合液中，在搅拌条件下加入APTES，回流10-25h，将反应产物洗涤、干燥，即得。

12.权利要求1或2所述的光电化学生物传感器在检测5hmC中的应用。

13.一种利用权利要求1或2所述的光电化学生物传感器检测5hmC的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以权利要求1或2所述的光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行光电化学信号检测，含有0.01-1M AA的Tris-HCl缓冲溶液，pH为6.0-8.5，建立电流与5hmC浓度之间的关系，对5hmC含量进行检测。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.5V。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-100mM。

设计说明书

技术领域

本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是一个重要的表观遗传修饰物，是5-甲基胞嘧啶(5mC)被TET家族酶催化氧化产生的，被称为DNA的第六碱基。5hmC早在1952年在噬菌体中被发现，但是当时并没有引起足够的重视。直到2009年，研究人员发现5hmC在小鼠、人大脑及胚胎干细胞中有着丰富表达才引起人们的重视。5hmC作为一个重要的表观遗传标志物在许多生命活动中发挥作用，例如调节基因活性、基因重组、细胞分化等。而且研究发现5hmC在癌细胞内的含量明显降低，因此实现对5hmC的检测具有重要意义。但是，由于5hmC和5mC结构相似，现有的生物检测方法很难将两者分开。

目前常用的检测5hmC的方法有单分子实时测序法、薄层色谱法、高效液相-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用技术等，但是这些方法普遍存在仪器昂贵，操作复杂，需专业人员操作等缺点。因此，实现对5hmC的快速、简单、灵敏检测十分重要。

光电化学分析是一种新兴的分析技术，具有电化学分析和光化学分析的优点。其利用光激发光电活性材料，产生光生电子和空穴。而光生电子则被电极捕获，产生电流。其激发光源和检测信号是完全不同的两种形式，这样可以有效地降低背景信号的干扰，从而极大地提高分析检测的灵敏度。黑色二氧化钛是一种新型的可见光催化材料，由于其独特的结晶核\/晶格紊乱的壳层结构，它的电子结构得到了改善，表面活性增强，不仅具有优异的光吸收性能，还具有优异的电学性质，这使得其在能源和环境领域有着广泛的应用。但目前尚未有基于黑色二氧化钛的光电化学分析方法检测5hmC的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法，实现了对5hmC的快速、简单和灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测5hmC的光电化学生物传感器，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO_{2<\/sub>、探针DNA、含有5hmC的互补DNA链、氨基苯硼酸、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)和氨基修饰的氧化锌。}

所述探针DNA与所述互补DNA链的碱基互补。

优选的，所述电极为ITO电极。

优选的，所述探针DNA的核苷酸序列为：

Probe DNA序列：5’-CGC GCG TAC ATC GGC CAC ATC T-P _{3<\/sub>O_{4<\/sub>-3’(SEQ ID NO.1)；}}

所述互补DNA链的核苷酸序列为：

5’-AGA TGT GGC CGA TGT ACG C ^{hm<\/sup>GC G-3’(SEQ ID NO.2)。}

本发明的第二方面，提供上述光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将电极进行预处理；

(2)将黑色TiO_{2<\/sub>固定在步骤(1)处理后的电极表面；}

(3)将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面；

(4)将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面；

(5)在糖基转移酶的催化作用下，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面；

(6)利用糖基上的邻二羟基与氨基苯硼酸的反应，将对氨基苯硼酸修饰到步骤(5)处理后的电极表面；

(7)利用氨基与羧基的反应，将PAMAM修饰到步骤(6)处理后的电极表面；

(8)利用氨基与羧基的反应，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面，即得到制备的生物传感器。

优选的，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗30-60min，晾干。更优选的，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:4。

未经预处理的电极上一般会有较大的过电势，从而导致反应迟钝、能耗升高。为了发挥电极的优势，提高电极的活性，需要对电极表面进行预处理。采用本发明的电极预处理方法可以降低的电极过电势，从而有效提高电极的活性。

优选的，步骤(2)中，所述黑色TiO_{2<\/sub>由如下方法制备而成：}

将白色TiO_{2<\/sub>和硼氢化钠按重量比为(0.5-2)：(0.5-2)研磨混匀，200-400℃氮气氛围下煅烧0.5-2h，得到黑色固体，洗涤、干燥，即得黑色TiO_2<\/sub>。}

优选的，步骤(2)中，将黑色TiO_{2<\/sub>固定到预处理后的电极表面的方法为：}

将黑色TiO_{2<\/sub>加入到去离子水中，超声分散，制成黑色TiO_{2<\/sub>分散液，将黑色TiO_{2<\/sub>分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥。}}}

更优选的，所述黑色TiO_{2<\/sub>与去离子水加入量的比为(10-20)mg:(3-10)mL。}

更优选的，超声分散的时间为1-3h。

优选的，步骤(3)中，将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面的方法为：

将包含DNA探针的探针固定液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。

更优选的，所述探针固定液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M NaCl、1-5mM TCEP；pH 6.0-8.5。

优选的，步骤(4)中，将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：

将10-40μL包含5hmC的DNA杂交液滴加到步骤(4)处理后的ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-4h。

优选的，所述DNA杂交液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M NaCl；pH6.0-8.5。

优选的，步骤(5)中，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面的方法为：

将包含糖基转移酶的糖基转移酶反应液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。

更优选的，所述糖基转移酶反应液中含有：3-15mM Tris-HCl、10-100mM NaCl、5-20mM MgCl _{2<\/sub>、0.5-4mM DTT；pH 6.0-8.5。}

优选的，步骤(6)中，将对氨基苯硼酸修饰到步骤(5)处理后的电极表面的方法为：

将对氨基苯硼酸溶液滴加到步骤(5)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。

优选的，步骤(7)中，将PAMAM修饰到步骤(6)处理后的电极表面的方法为：

将对PAMAM溶液滴加到步骤(6)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。

优选的，步骤(8)中，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面的方法为：

将修饰氨基的ZnO分散液滴加到步骤(7)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h。

更优选的，所述修饰氨基的ZnO由如下方法制备而成：

将醋酸锌加入到无水乙醇中，搅拌均匀，在搅拌条件下加入NaOH溶液，于120-180℃条件下反应4-8h，得到第一产物；

将第一产物洗涤，然后加入到NaOH溶液中，60-90℃搅拌回流反应15-25h，得到第二产物；

将第二产物洗涤，然后加入到乙醇-水混合液中，在搅拌条件下加入APTES，回流10-25h，将反应产物洗涤、干燥，即得。

上述光电化学生物传感器在检测5hmC中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学生物传感器检测5hmC的方法，包括以下步骤：

以上述光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行光电化学信号检测，含有0.01-1M抗坏血酸(AA)的Tris-HCl缓冲溶液(pH为6.0-8.5)，建立电流与5hmC浓度之间的关系，对5hmC含量进行检测。

优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.5V。

优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-100mM。

需要说明的是，上述检测方法可以用在非疾病诊断方面，可以通过检测5hmC的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用黑色TiO_{2<\/sub>良好的光电活性和ZnO对黑色TiO_{2<\/sub>光电信号的猝灭作用，实现对5hmC的灵敏检测。}}

(2)利用PAMAM树状大分子扩大引入信号分子的数量，提高5hmC的检测灵敏度。

(3)利用糖基转移酶对5hmC上羟甲基的特异性催化作用，提高5hmC检测的特异性。

(4)本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对5hmC的检测。

附图说明

图1：本发明的5hmC检测的原理图。

图2：不同浓度的5hmC的光电化学响应曲线；曲线a-i代表的浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200nM的5hmC。

图3：光电流对数值与5hmC浓度的线性拟合曲线。

图4：不同核苷酸条件下的光电化学响应变化的柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明中的“室温”的范围为20-30℃。

本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。

本发明中所使用的清洗液的成分为：3-15mM Tris-HCl和20-60mM KCl，pH 6.0-8.5。

本发明中所使用的探针固定液的成分为：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5MNaCl、1-5mM TCEP，pH 6.0-8.5。

本发明中所使用的DNA杂交液的成分为：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5MNaCl，pH 6.0-8.5。

本发明中所使用的糖基转移酶反应液的成分为：3-15mM Tris-HCl、10-100mMNaCl、5-20mM MgCl _{2<\/sub>、0.5-4mM DTT，pH 6.0-8.5。}

本发明中所使用的检测液为：10-100mM Tris-HCl、0.01-1M AA，pH为6.0-8.5。

正如背景技术部分所介绍的，现有的5hmC检测方法存在仪器昂贵，操作复杂，需专业人员操作等缺点，难以实现对5hmC的快速、灵敏检测。

基于此，本发明的目的是提供一种新的能够快速、灵敏检测5hmC的方法。

黑色TiO_{2<\/sub>以其独特的光学、电化学等性质被应用到能源和环境领域。但是利用黑色TiO_{2<\/sub>的光电活性来检测5hmC，目前还未见有报道。}}

本发明首次构建了一种基于黑色TiO_{2<\/sub>光电活性的光电化学传感器，利用黑色TiO_{2<\/sub>的光电性能、糖基转移酶对5-羟甲基胞嘧啶的专一性催化、PAMAM信号扩增作用以及ZnO的信号猝灭，实现对5-羟甲基胞嘧啶的快速、灵敏检测。}}

本发明的光电化学传感器的构建过程以及检测原理如图1所示。首先将黑色TiO_{2<\/sub>修饰于电极表面，利用黑色TiO_{2<\/sub>优异的光电活性产生一个稳定的光电流。接着利用磷酸基团与TiO_{2<\/sub>的反应将一端修饰磷酸基团的探针DNA固定在电极表面。然后，利用碱基互补配对将5hmC固定于电极表面。随后，利用糖基转移酶对5hmC的特异性催化引入糖基，利用糖基上邻二羟基与氨基苯硼酸反应，将氨基引入电极表面。最后，利用氨基与羧基的反应依次将PAMAM与氨基修饰的ZnO引入电极表面。由于ZnO与黑色TiO_{2<\/sub>竞争吸收光以及自由电子导致光电信号降低。由于5hmC的浓度决定引入ZnO的数量。因此，基于5hmC的浓度与光电流的线性关系，可实现对5hmC的灵敏检测。}}}}

在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学生物传感器的构建过程为：

(1)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成1×5cm^{2<\/sup>，然后用乙醇\/NaOH混合液(比例为1:1-1:4)，丙酮和二次水分别超声清洗30-60分钟，并在室温下晾干，待用。}

(2)黑色TiO_{2<\/sub>的制备：称取0.5-2g白色TiO_{2<\/sub>，0.5-2g硼氢化钠于研钵中研磨混匀。将混合物放入瓷舟中，200-400℃氮气氛围下煅烧0.5-2h。得到黑色固体分别用去离子水和无水乙醇洗三遍，60℃真空干燥备用。}}

(3)氨基修饰氧化锌的制备：称取0.1-1g醋酸锌加入50mL无水乙醇中，搅拌均匀。然后，搅拌情况下加入10-30mL 0.5M NaOH溶液。接着将上述溶液转移到反应釜中120-180℃反应4-8h。产物用去离子水和无水乙醇洗三遍，然后称取0.5-1.5g上述产物加入100mL0.5M NaOH溶液中搅拌60-90℃回流15-25h。产物水洗三遍之后加入乙醇和水的混合溶液中(1：1-1：6)。搅拌情况下，加入3-5mL APTES接着回流10-25h。最后，产物水洗三遍并60℃真空干燥备用。

将制备的氨基修饰氧化锌加入到去离子水中，超声分散，制备得到氨基修饰ZnO分散液，所述氨基修饰ZnO分散液中，氨基修饰ZnO的浓度为0.5-6mg\/mL。

(4)黑色TiO_{2<\/sub>分散液的制备：称取10-20mg黑色TiO_{2<\/sub>，加入到3-10mL去离子水中，超声分散1-3小时。}}

(5)黑色TiO_{2<\/sub>的固定：将10-40μL黑色TiO_{2<\/sub>分散液滴加到预处理后的电极表面，在红外灯下烤干。制备的电极标记为TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}}

(6)探针DNA的固定：将10-40μL包含1μM探针DNA的探针固定液滴加到TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为ssDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

(7)5hmC的固定：将10-40μL包含含有5hmC的DNA互补链的DNA杂交液滴加到ssDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

(8)5hmC的糖基化：将10-40μL包含糖基转移酶的糖基转移酶反应液(60unit\/mL)滴加到5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

(9)对氨基苯硼酸的固定：将10-40μL对氨基苯硼酸溶液(1μM)滴加到Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

(10)PAMAM的固定：将10-40μL PAMAM溶液(10wt.％in methanol)滴加到M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO _{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

(11)ZnO的固定：将10-40μL氨基修饰ZnO分散液(0.5-6mg\/mL)滴加到PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化1-4h。然后，将电极冲洗3-5次。制备的电极标记为ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

上述光电化学传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。固定修饰在ITO电极表面的材料可以是市售产品，也可自行制备得到，只要性能上满足使用要求即可，本发明不做特别的限定。

在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学生物传感器检测5hmC的过程为：

(1)用不同浓度的5hmC制备ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极，并以其作为工作电极，饱和甘汞电极、铂丝分别作为参比电极和辅助电极组成三电极体系。以500W氙灯作为光源，应用电位为-0.5-0.5V，检测液为10-100mM Tris-HCl、0.01-1M AA(pH6.0-8.5)进行光电流检测；}

(2)建立电流与5hmC浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中的5hmC的含量进行检测。

随着5hmC浓度的增加，电极表面的ZnO数量增加，导致光电流信号降低。根据5hmC浓度与电流的线性关系，可实现对5hmC的检测。

需要说明的是，本发明的光电化学生物传感器主要是用于检测核苷酸样品中的5hmC的含量。在获得含有5hmC的核苷酸样品的序列的基础上，根据碱基互补配对原则，设计探针DNA，构建本发明的光电化学生物传感器，从而实现对核苷酸样品中5hmC含量的检测。

本发明的光电化学生物传感器对5hmC的检测范围为0.05-200nM，检测限为2.12pM。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：黑色TiO_{2<\/sub>的制备}

称取1g白色TiO_{2<\/sub>，1g硼氢化钠于研钵中研磨混匀。将混合物放入瓷舟中，250℃氮气氛围下煅烧1h。得到黑色固体分别用去离子水和无水乙醇洗三遍，60℃真空干燥备用。}

实施例2：氨基修饰氧化锌的制备

称取0.4g醋酸锌加入50mL无水乙醇中，搅拌均匀。然后，搅拌情况下加入25mL0.5M NaOH溶液。接着将上述溶液转移到反应釜中150℃反应6h。产物用去离子水和无水乙醇洗三遍，然后称取1g上述产物加入100mL 0.5M NaOH溶液中搅拌70℃回流20h。产物水洗三遍之后加入乙醇和水(1：1)的混合溶液中。搅拌情况下，加入3mL APTES接着回流20h。最后，产物水洗三遍并60℃真空干燥备用。

实施例3：ITO电极预处理

将ITO导电玻璃分割成1×5cm^{2<\/sup>，然后用乙醇\/NaOH混合液(1:1)、丙酮和二次水分别清洗45分钟，并在室温下晾干，待用。}

实施例4：黑色TiO_{2<\/sub>的固定}

黑色TiO_{2<\/sub>分散液的制备：称取12mg黑色TiO_{2<\/sub>固体，加入到3mL去离子水中，超声分散2小时，得到黑色TiO_{2<\/sub>分散液。}}}

将40μL黑色TiO_{2<\/sub>分散液滴加到预处理后的ITO电极(1×5cm^{2<\/sup>)表面，红外灯照射干燥。制备的电极标记为TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}}

实施例5：5hmC的固定

将20μL包含1μM探针DNA(SEQ ID NO.1所示)的探针固定液滴加到TiO _{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。接着将20μL包含含有5hmC的DNA互补链(SEQ ID NO.2所示)的DNA杂交液滴加到电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为5hmC-dsDNA\/TiO _{2<\/sub>\/ITO。}}

实施例6：5hmC的糖基化

将40μL包含糖基转移酶的糖基转移酶反应液(60unit\/mL)滴加到5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO。}}

实施例7：氨基修饰ZnO的固定

将40μL对氨基苯硼酸溶液(1μM)滴加到Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。接着将40μL PAMAM溶液(10wt.％inmethanol)滴加到电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。最后，将40μL氨基修饰ZnO分散液滴加到电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿环境孵化2h。然后，将电极冲洗3次。制备的电极标记为ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO _{2<\/sub>\/ITO。}}

实施例8：光电化学检测

以ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极，饱和甘汞电极，铂丝电极分别为工作电极，参比电极，辅助电极，含有0.1M AA的10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)在电化学工作站上进行光电流信号采集。建立光电流与5hmC浓度之间的关系，线性范围为0.05-200nM，校正曲线为I(nA)＝-21.81logc(nM)+173.89(R＝0.9944)，检出限为2.12pM(图2和图3)。}

实施例9：选择性检测

选择性是光电化学传感器性能的一个重要指标，因此我们选择5-甲基胞嘧啶(5mC)和N-6甲基腺嘌呤(m6A)作为干扰物对传感器的选择性进行研究。并对不同干扰试剂参与构建的传感器的光电流变化值(ΔI＝I_{1<\/sub>-I_{2<\/sub>，I_{1<\/sub>是ssDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO的电流值，I_{2<\/sub>是ssDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO经过不同干扰物处理后的电极继续经糖基转移酶，对氨基苯硼酸，PAMAM，ZnO处理后的电极的光电流流值，干扰物和5hmC的浓度均为1nM)进行了对比。结果表明，干扰物参与构建传感器电流值变化明显低5hmC，表明构建的传感器具有很好的特异性(图4)。}}}}}}

实施例10：稳定性实验

采用相同的方法制备10支ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO_{2<\/sub>\/ITO电极，然后在含有0.1M AA的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)中进行光电流信号检测，得到电流的相对标准偏差为4.32％，说明该方法有很好的重现性。将ZnO\/PAMAM\/M-APBA\/Glu\/5hmC-dsDNA\/TiO _{2<\/sub>\/ITO传感器在4℃下存放2周，再进行光电流检测，得到电流响应为原始响应的92.56％，说明该方法有很好的稳定性。}}

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcgcgtaca tcggccacat ct 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agatgtggcc gatgtacgcg cg 22

设计图

一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法论文和设计

一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法论文和设计-殷焕顺

全文摘要

主设计要求

设计方案

设计说明书

设计图

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