应用“间接谱系转化”技术重编程小鼠胚胎成纤维细胞成为诱导性少突胶质细胞祖细胞的研究

论文摘要

“间接谱系转化”技术借助基因载体,通过表达转录因子,将已分化的体细胞重编程成为特定谱系的祖细胞,为再生医学提供了安全、高效的新途径。神经细胞轴突外的髓鞘对于神经系统的信号传导和脑内稳态的维持至关重要,髓鞘的缺失或功能障碍会导致众多疾病,例如多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）和脑白质营养不良。少突胶质细胞祖细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）的移植是治疗髓鞘相关疾病的一种潜在方法。然而,体内OPCs在大脑中仅占约5-8%,且在成人脑中维持缓慢增殖或静止的状态。因此,在脑损伤后,通过OPCs分化成为少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）进而修复损伤髓鞘的能力十分有限。鉴于此,本研究通过过表达三种神经转录因子（Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10）,将小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEFs）——NIH/3T3细胞重编程成为诱导性少突胶质细胞祖细胞（Induced oligodendrocyte precursor cells,iOPCs）,其形态学和基因表达与原代OPCs相似,并具有体外分化的能力,为脱髓鞘疾病的细胞代替治疗、疾病模型构建和药物开发等奠定了基础。试验一:昆明小鼠原代OPCs的体外分离、培养和诱导分化小鼠OPCs是一种在体外极易受到损伤、不易存活的细胞。为了优化小鼠OPCs的体外分离培养体系,高效获得OPCs,并将其作为评估iOPCs质量的对照组,本研究通过探讨不同胎龄和消化方法对OPCs生长状况、细胞总数以及存活率的影响,筛选适宜条件,进一步优化OPCs的分离、纯化方案。结果表明:（1）采用0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化胎龄为18.5天小鼠胎儿脑皮质,所得的OPCs数量最多,与其余处理组之间均存在显著性差异（P<0.05）,且极显著性高于对照组（P<0.01）;（2）与1日龄新生小鼠相比,采用胎龄为18.5天的小鼠胎儿更容易分离得到OPCs,仅培养7-9天,细胞之间出现明显分层,且增殖速度较快,极大缩短了细胞培养时间;（3）无论是胎龄为18.5天的胎鼠还是1日龄新生小鼠,采用改良后的间隔震荡纯化方法纯化OPCs的存活率极显著性高于传统纯化方法（P<0.01）,且其纯度较高（>97%）;（4）分离所得OPCs能够在含有40 ng/mL三碘甲状腺氨酸（Triiodothyronine,T3）的无血清诱导培养液中分化成为OLs,在含10%胎牛血清的培养液中分化成为Ⅱ型星形胶质细胞,且体外分化所得细胞的纯度可达95%以上。因此,采用胎龄为18.5天的小鼠胎儿进行脑皮质的采集,经0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化15 min的方法可以获得具有典型形态、生长良好且具有体外定向诱导分化能力的OPCs。试验二:不同载体介导神经转录因子Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞的条件优化为了提高神经转录因子Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞的效率,为iOPCs的制备奠定基础,本研究分别采用不同浓度（2.5μg/mL、5μg/mL和7.5μg/mL）的非病毒转染载体（Lipofectamine 2000和Lipofectamine LTX）结合不同浓度（1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL和5μg/mL）的质粒DNA,且采用磁纳米颗粒载体与质粒DNA 1:1结合后转染NIH/3T3细胞,以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）基因作为报告基因,通过比较不同处理组的转染效率和细胞毒性,筛选出转染效率高、细胞毒性小的转染条件。结果表明:三种试剂的最高转染效率处理组（7.5μg/mL Lipofectamine 2000结合3μg/mL质粒DNA处理组、7.5μg/mL Lipofectamine LTX结合2μg/mL质粒DNA处理组、2μg/mL Poly-MAG结合2μg/mL质粒DNA处理组）之间无显著性差异（P>0.05）。但是,当三种试剂的转染效率达到最高时,Poly-MAG转染试剂对NIH/3T3细胞的毒性极显著性低于Lipofectamine 2000与Lipofectamine LTX转染试剂的细胞毒性（P<0.01）。此外,由于磁性纳米颗粒载体Poly-MAG具有顺磁性,在外源性磁场的作用下,它能够快速地吸引至到细胞表面,有助于Olig 2质粒DNA的稳定表达。因此,宜采用2μg/mL Poly-MAG介导2μg/mL Olig 2质粒DNA转染NIH/3T3细胞。试验三:应用“间接谱系转化”技术重编程NIH/3T3细胞成为iOPCs的可行性研究为了建立NIH/3T3细胞向iOPCs的“间接谱系转化”体系,本试验采用磁性纳米颗粒载体Poly-MAG介导Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10转录因子在NIH/3T3细胞中过表达,并对重编程所得细胞进行形态学观察、免疫细胞化学染色、荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）以及Western Blot检测,旨在获得iOPCs,为髓鞘再生机制研究、药物筛选和细胞移植治疗等奠定基础。结果表明:重编程所得细胞具有以下特征:（1）具有OPCs的典型形态学特征,细胞呈圆形或椭圆形生长,折光性强,多数有两个突起,少数有三个突起,与小鼠原代OPCs十分类似;（2）表达OPCs特异性抗原——A2B5,A2B5+细胞的数量占68.37±2.05%;（3）与对照组相比,重编程所得细胞的PDGFRα、S100β、NG2和Olig 2基因的表达量呈现出极显著性的上调（P<0.01）;（4）能够体外诱导分化成为MBP+的OLs和GFAP+的Ⅱ型星形胶质细胞,其阳性率分别为72.67?2.52%和75.36?1.98%;（5）与小鼠原代OPCs相比,iOPCs的A2B5蛋白水平差异不显著（P>0.05）,这说明过表达三个神经转录因子所得到的细胞与小鼠原代OPCs相似,有OPCs特异性蛋白A2B5的表达。因此,采用Poly-MAG介导Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的过表达能够将已分化的NIH/3T3细胞重编程成为iOPCs。结论:宜采用0.125%胰蛋白酶结合0.25%鸡血清消化18.5天胎龄昆明小鼠胚胎的脑皮质,混合培养7-9天后细胞出现明显分层,通过间隔震荡纯化方法,可以高效获得形态正常、增殖较快且具有分化能力的OPCs;在外源性磁场的作用下,采用2μg/mL Poly-MAG结合2μg/mL Olig 2质粒DNA能够更为高效地转染NIH/3T3细胞,且细胞毒性较低;利用该磁性纳米颗粒转染体系介导三个神经转录因子Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的过表达能够将NIH/3T3细胞重编程成为iOPCs,为脱髓鞘机制的研究和相关疾病的治疗等提供了丰富的细胞资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1 哺乳动物细胞谱系转化技术的研究进展
•     1.1“直接谱系转化”技术
•     1.2“间接谱系转化”技术
•   2 诱导iOPCs生成策略的研究进展
•     2.1 转录因子
•       2.1.1 Olig 2
•       2.1.2 Sox 10
•       2.1.3 八聚体结合转录因子 4（Octamer-binding transcription factor 4，Oct 4）
•       2.1.4 NK6同源盒转录因子 2（NK 6 homeobox transcription factor 2，Nkx 6.2）
•       2.1.5 锌指蛋白 536（Zinc finger protein，Zfp 536）
•     2.2 miRNA
•       2.2.1 miR-219
•       2.2.2 miR-338
•       2.2.3 其他miRNA
•     2.3 小分子物质
•       2.3.1 血小板源生长因子AA（Platelet-derived growth factor AA，PDGF-AA）
•       2.3.2 SHH
•       2.3.3 成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）
•     2.4 转染载体
•   3 iOPCs的应用
•   4 iOPCs的现存问题
• 第2章 试验部分
•   引言
•   试验一 昆明小鼠原代OPCs的体外分离、培养和诱导分化
•     1 材料
•       1.1 实验动物
•       1.2 主要仪器与设备
•       1.3 主要药品与试剂
•       1.4 主要溶液的配制
•     2 方法
•       2.1 昆明小鼠OPCs的原代分离培养
•       2.2 昆明小鼠OPCs的传代培养
•       2.3 昆明小鼠OPCs的体外诱导分化
•     2.3.1 OPCs体外诱导分化成为OLs
•     2.3.2 OPCs体外诱导分化成为Ⅱ型星形胶质细胞
•       2.4 免疫细胞化学染色
•       2.5 数据统计分析
•     3 结果与分析
•       3.1 不同浓度的胰蛋白酶和鸡血清对小鼠OPCs体外分离效率的影响
•     3.1.1 形态学观察
•     3.1.2 细胞总数
•     3.1.3 细胞存活率
•       3.2 不同纯化方案对小鼠OPCs分离效率的影响
•     3.2.1 形态学观察
•     3.2.2 细胞总数和存活率
•     3.2.3 免疫细胞化学染色
• +细胞率'>    3.2.4 A2B5⁺细胞率
•       3.3 昆明小鼠OPCs的体外诱导分化
•     3.3.1 形态学观察
•     3.3.2 免疫细胞化学染色
•     3.3.3 OPCs及其体外诱导分化细胞的阳性率
•     4 讨论
•       4.1 胰蛋白酶和鸡血清对小鼠OPCs体外分离的影响
•       4.2 不同纯化方案对小鼠OPCs的影响
•       4.3 昆明小鼠OPCs的体外诱导分化
•     5 小结
•   试验二 不同载体介导神经转录因子Olig 2 质粒DNA转染NIH/3T3细胞的条件优化
•     1 材料
•       1.1 细胞
•       1.2 质粒
•       1.3 主要仪器与设备
•       1.4 主要药品和试剂
•       1.5 主要溶液配制
•     2 方法
•       2.1 NIH/3T3细胞的培养
•     2.1.1 NIH/3T3细胞的复苏
•     2.1.2 NIH/3T3细胞的传代
•     2.1.3 NIH/3T3细胞的冻存
•       2.2 免疫细胞化学染色
•       2.3 质粒构建
•       2.4 质粒DNA的提取
•       2.5 质粒DNA酶切验证
•     2.5.1 1%琼脂糖凝胶的制备
•     2.5.2 样品准备
•     2.5.3 酶切及电泳检测
•       2.6 三种转染试剂介导Olig 2质粒DNA进入NIH/3T3细胞的条件优化
•     2.6.1 Lipofectamine 2000 转染NIH/3T3细胞
•     2.6.2 Lipofectamine LTX Reagent转染NIH/3T3细胞
•     2.6.3 Poly-MAG转染NIH/3T3细胞
•       2.7 LDH法检测三种转染试剂转染NIH/3T3细胞的细胞毒性
•       2.8 数据分析
•     3 结果与分析
•       3.1 NIH/3T3细胞的体外培养
•     3.1.1 形态学观察
•     3.1.2 免疫细胞化学染色
•       3.2 质粒DNA提取
•     3.2.1 菌液电泳
•     3.2.2 酶切验证
•       3.3 三种转染试剂转染NIH/3T3细胞
•     3.3.1 不同浓度三种转染试剂的转染效率
•     3.3.2 不同浓度三种转染试剂的细胞毒性
•     3.3.3 三种转染试剂的最佳转染效率比较
•     4 讨论
•     5 小结
•   试验三 应用“间接谱系转化”技术重编程NIH/3T3细胞成为iOPCs的可行性研究
•     1 材料
•       1.1 实验动物及细胞
•       1.2 主要仪器与设备
•       1.3 主要药品与试剂
•       1.4 主要溶液的配制
•     2 方法
•       2.1 适宜浓度G418的筛选
•     2.1.1 NIH/3T3细胞的培养
•     2.1.2 适宜浓度G418的筛选
•       2.2 Poly-MAG介导NIH/3T3细胞的转染
•       2.3 NIH/3T3细胞稳定转染克隆的筛选
•       2.4 iOPCs的鉴定
•     2.4.1 免疫细胞化学染色
•     2.4.2 RT-PCR
•     2.4.3 Western Blot
•       2.5 iOPCs的体外增殖
•     2.5.1 iOPCs形态学观察
•     2.5.2 细胞增殖检测
•       2.6 iOPCs的体外分化
•     2.6.1 形态学观察
•     2.6.2 免疫细胞化学染色
•     2.6.3 RT-PCR
•       2.7 数据分析
•     3 结果与分析
•       3.1 适宜浓度G418 的筛选
•     3.1.1 形态学观察
•     3.1.2 适宜浓度G418 筛选
•       3.2 NIH/3T3细胞的转染
•       3.3 iOPCs的鉴定
•     3.3.1 免疫细胞化学染色
•     3.3.2 RT-PCR
•     3.3.3 Western Blot
•       3.4 iOPCs的增殖
•     3.4.1 形态学观察
•     3.4.2 细胞增殖率
•       3.5 iOPCs的体外诱导分化
•     3.5.1 形态学观察
•     3.5.2 免疫细胞化学染色
•     3.5.3 iOPCs及其体外诱导分化所得细胞的阳性率
•     3.5.4 RT-PCR
•     4 讨论
•       4.1 体外诱导iOPCs的生成
•       4.2 iOPCs的体外增殖及诱导分化
•     5 小结
• 总结
• 参考文献
• 附录 缩略词表
• 在读期间发表论文及参加课题参研情况一览表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 令文慧

导师: 李跃民,肖雄

关键词: 间接谱系转化,细胞,重编程,诱导性少突胶质细胞祖细胞,分化

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 西南大学

基金: 国家自然科学基金面上项目“‘间接谱系转化’结合纳米技术重编程小鼠胚胎成纤维细胞成为少突胶质细胞的研究”(31572488)

分类号: R329.2

总页数: 107

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