产尿酸氧化酶基因工程菌的构建

论文摘要

尿酸氧化酶（Urate Oxidase,EC 1.7.3.3）可以催化降解尿酸生成溶解度为尿酸十几倍的尿囊素,是嘌呤代谢过程的重要酶。由于生物进化过程中人体内的尿酸氧化酶基因突变,导致尿酸氧化酶失去活性,因此人体的尿酸含量一直较高,而过高的尿酸会引起痛风等一系列疾病。作为一种可以快速降低尿酸含量的酶,尿酸氧化酶在医学方面有着重大应用潜力。但是由于产量低,纯化较为复杂,其高额的成本使得在国内没有大规模推广应用,因此构建一株有高产尿酸氧化酶的基因工程菌株是非常有意义的。本文选用大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）和毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主,过表达来源于黄曲霉的尿酸氧化酶的基因（uox）,并对培养条件、密码子进行优化提高尿酸氧化酶产量,此外通过表达分子伴侣蛋白、转运因子、折叠因子和转录因子等方式进一步提高尿酸氧化酶产量。本论文主要工作如下:（1）在大肠杆菌BL21（DE3）中导入了来源于黄曲霉尿酸氧化酶基因（uox）,构建了产尿酸氧化酶的基因工程菌株E.uox,尿酸氧化酶产量为2.09 mg/L。对尿酸氧化酶基因进行密码子优化,尿酸氧化酶的产量提高到2.66 mg/L。进一步地,对该重组菌株发酵过程中发酵时间、诱导剂添加量、诱导温度等条件进行优化,在发酵11 h后得到4.03 mg/L的尿酸氧化酶,经镍柱纯化后的尿酸氧化酶酶活为8.11 U/mg。为了进一步促进尿酸氧化酶表达,在菌株E.uox中分别导入了分子伴侣tig、dnaK-dnaj-GrpE、GroES-GroEL促进其翻译后折叠,产量分别提高至6.07 mg/L、6.66 mg/L、4.82 mg/L,而导入了分子伴侣tig-GroES-GroEL 的菌株产量有所下降,为3.15 mg/L。最后对发酵条件进行正交实验优化,在最优发酵条件下产量为8.77 mg/L,可溶性目的蛋白占总蛋白的62%。（2）以毕赤酵母GS115为宿主导入尿酸氧化酶基因uox,筛选高拷贝的菌株最终得到P.uox-11和P.uox-16两株菌株,发酵6天后发酵液酶活分别为0.746 U/mL和0.793 U/mL,纯化后的酶活为9.32 U/mg和9.41 U/mg,酶产量分别为80.04 mg/L和84.12 mg/L。通过验证拷贝数,得到了在筛选范围内拷贝数和酶表达量的粗略关系。（3）从P.uox-11菌株出发,从转运、折叠、转录三方面调控,提高酶表达量。在导入了折叠因子Sec53后产量没有明显提升。折叠方面通过表达PDI、Kar2p、CNE1折叠因子,发酵6天后发酵液中的酶表达量分别提高表至92.4 mg/L、96.1 mg/L和87.3 mg/L,酶表达量分别提高了 18.4%、22.8%和11.9%。转录方面通过表达HAC1转录因子提高酶表达量至100.3 mg/L,酶表达量高了 28.6%,构建了有较高产量的尿酸氧化酶分泌型表达菌株。最后,通过正交试验优化,对表达了 PDI折叠因子的菌株进行发酵条件优化,最终酶表达量达到了 104.5 mg/L,提高了13.1%。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 尿酸
•     1.1.1 尿酸的产生
•     1.1.2 尿酸与疾病
•   1.2 尿酸氧化酶
•     1.2.1 尿酸氧化酶概况
•     1.2.2 尿酸氧化酶的研究进展
•     1.2.3 人体中的尿酸氧化酶基因及其在进化中的意义
•     1.2.4 尿酸氧化酶的研究意义
•   1.3 分子伴侣
•     1.3.1 大肠杆菌中的分子伴侣
•     1.3.2 酵母中的分子伴侣
•   1.4 本课题研究的意义
•   1.5 本课题的研究思路
•     1.5.1 课题的研究内容
•     1.5.2 课题的研究方案
• 第二章 产尿酸氧化酶大肠杆菌菌株的构建
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     2.2.2 实验相关试剂、仪器
•     2.2.3 实验相关培养基
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 质粒的构建与发酵方法
•     2.3.2 摇瓶发酵及尿酸氧化酶活性的测定
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 pET-28a-uox质粒的构建
•     2.4.2 pET-28a-E.uox质粒的构建
•     2.4.3 尿酸含量标准曲线
•     2.4.4 BSA标准曲线
•     2.4.5 诱导剂浓度对尿酸氧化酶表达的影响
•     2.4.6 诱导时间对尿酸氧化酶表达的影响
•     2.4.7 诱导温度对尿酸氧化酶表达的影响
•     2.4.8 分子伴侣对尿酸氧化酶表达的影响
•     2.4.9 保有分子伴侣质粒的基因工程菌株的构建
•     2.4.10 分子伴侣对尿酸氧化酶表达的影响
•     2.4.11 正交条件优化
•   2.5 本章小结
• 第三章 产尿酸氧化酶毕赤酵母菌株的构建
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     3.2.2 实验相关仪器、试剂
•     3.2.3 实验相关培养基
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 质粒构建
•     3.3.2 质粒线性化
•     3.3.3 毕赤酵母的感受态制备以及电转化法
•     3.3.4 毕赤酵母转化子验证
•     3.3.5 筛选遗传霉素抗性转化子方法
•     3.3.6 荧光定量PCR
•     3.3.7 发酵方法
•   3.4 实验结果和讨论
•     3.4.1 产尿酸氧化酶毕赤酵母的构建
•     3.4.2 密码子优化对尿酸氧化酶产量的影响
•     3.4.3 拷贝数对尿酸氧化酶产量的影响
•     3.4.4 发酵时间对尿酸氧化酶产量的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 分子伴侣的表达
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     4.2.2 实验相关仪器、试剂
•     4.2.3 实验相关培养基
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 质粒构建
•     4.3.2 发酵方法
•   4.4 实验结果和讨论
•     4.4.1 Pgap启动子介导的调控因子对目的蛋白的影响
•     4.4.2 Paox1启动子介导的调控因子对目的蛋白产量的影响
•     4.4.3 发酵条件优化
•   4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 导师和作者简介
• 附录
•   附录1 本文使用的仪器设备
•   附录2 本文使用的试剂及试剂盒
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘乐天

导师: 陈必强,谭天伟

关键词: 尿酸氧化酶,大肠杆菌,毕赤酵母,分泌型表达,分子伴侣

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q78

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000123

总页数: 115

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