一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法论文和设计-余红兵

全文摘要

本发明公开了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法,具体为:先设计p73基因位点特异性sgRNA序列,克隆进质粒PX459;整合p73基因同源重组序列以及绿色荧光蛋白DNA片段(EGFP),将上述质粒和整合片段共同电击转化大肠癌细胞系HCT116;通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞,并扩增单克隆细胞系;筛选的EGFP表达细胞系通过PCR鉴定及免疫印迹验证阳性p73报告基因细胞系。该大肠癌细胞系p73基因和EGFP共同表达,其EGFP表达水平和p73基因具有高度一致性,故通过检测EGFP表达水平变化可以准确判断p73基因表达水平。本发明建立细胞系方法简单、易行、高效和精准定位基因位点。

主设计要求

1.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法,包括以下步骤:步骤1:p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估;步骤2:构建pX459\/p73-sgRNA质粒;步骤3:整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段;步骤4:将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116;步骤5:通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞,并扩增单克隆细胞系;步骤6:筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73报告基因细胞系;其中,所述步骤1中,设计并筛选出p73-sgRNA序列,所述p73-sgRNA的序列如SEQIDNO:1所示;所述步骤2中,构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如下:根据所述p73-sgRNA的序列,经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459\/p73-sgRNA;步骤3中,整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下:根据p73基因的同源重组序列和EGFP序列,经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R;所述片段L-EGFP-R的序列如SEQIDNO.2所示。

设计方案

1.一种大肠癌p73报告基因细胞系,其特征在于,所述细胞系的p73基因与下游报告基 因通过2A肽连接实现共表达。

2.根据权利要求1所述的细胞系,所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、 LOVO、HT29或DLD-1,进一步优选为HCT116。

3.根据权利要求1所述的细胞系,所述报告基因通过CRISPR-Cas9技术转入p73基因下 游。

4.根据权利要求1所述的细胞系,所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。

5.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法,包括以下步骤:

步骤1:p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估;

步骤2:构建pX459\/p73-sgRNA质粒;

步骤3:整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段;

步骤4:将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击 转化大肠癌细胞系HCT116;

步骤5:通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞,并扩增单克隆细胞系;

步骤6:筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73 报告基因细胞系。

6.根据权利要求5所述的方法,所述步骤1中,设计并筛选出p73-sgRNA序列,所述p73- sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求5或6所述的方法,所述步骤2中,构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如 下:根据所述p73-sgRNA的序列,经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒 pX459\/p73-sgRNA;步骤3中,整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下:根据p73 基因的同源重组序列和EGFP序列,经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R; 所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法制备获得的细胞系。

9.权利要求1-4任一项所述的细胞系或权利要求8所述的细胞系在下述(1)-(4)中任一 的应用:

(1)在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用;

(2)在细胞模型中的应用

(3)在研究p73基因中的应用;或

(4)在药物筛选中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用,所述肿瘤为大肠癌;所述细胞模型为肿瘤细胞模型,优 选为大肠癌细胞模型;所述药物为抗癌药物。

设计说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种大肠癌p73报告基因细胞系及其建立方 法。

背景技术

报告基因是分子生物学研究领域中一种重要的工具,经常被用做标记所要研究的 目标基因,使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致,从而可以通过对报告 基因的表达来观察目标基因的表达调控。报告基因具有便捷、可靠、灵敏度高和高通量检测 等优点。目前常用到的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶和荧光蛋白等。作为无毒无害的 检测工具,荧光素酶和荧光蛋白在检测细胞基因表达方面占据着主导地位。

CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的成簇规律间隔短回文重复序列组成的适应性 免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵。Cas蛋白有若干种,具有内切核酸酶活性。 CRISPR-Cas系统拥有三种类别,其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入、应用最成熟的一种类 别;其具有操作简便,作用位点选择灵活性强,活性高等优势。在人为设计的sgRNA的指导 下,表达的具有核酸内切酶活性的Cas蛋白会向基因靶点位置移动,最终结合于基因靶点处 发挥作用,当细胞基因组完整性被Cas蛋白酶破坏,细胞自身的自我修复系统便会被激活, 在带有基因组同源片段的外源目标基因存在的情况下,细胞则会以一定概率的同源重组方 式对自身基因组进行修复,从而实现外源基因的插入。

p73基因(Homo sapiens tumor protein p73,TP73,GenBank ID:NG_017035.2)是 p53转录因子家族的一员,p53基因家族还包括p53基因和p63基因。p73基因是Kaghad等研究 者于1997年筛选胰岛素介导的细胞信号转导因子时,在用对应IRS-1连接区的简并寡核苷 酸探针对COS细胞的cDNA文库进行杂交筛选,偶然发现了1个假阳性的cDNA克隆,序列与p53 基因有高度的同源性(Nature,1997.389:191-194.)。p73基因与p53基因所编码的蛋白质结 构与功能上差异不大,p73基因能以P53基因同样的方式激活p53的靶基因、诱导细胞凋亡并 抑制细胞生长(Clinical Cancer Research,2002.8(1):165-170.)。许多研究者均提示p73 基因可能通过其静止基因的激活或过度表达参与部分肿瘤的形成(Cell Biology, 2007.178:283-296.)。近年来相关研究表明,p73基因表达水平相关于肿瘤分化,癌细胞分 化越低,该基因的表达越高(Molecular Cancer Research,2016.14(1):56-65.)。综上所 述,p73基因的检测对肿瘤的诊断、分期及预后判断有重要的参考意义。

本研究关于大肠癌p73报告基因领域,利用CRISPR-Cas9技术构建了带有增强型绿 色荧光蛋白(EGFP)的大肠癌p73报告基因的细胞系,为p73基因及其信号通路的研究、相关 疾病致病机理的研究、药物筛选与评价工作提供了有利工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大肠癌p73报告基因细胞系,其特征在于,所述细 胞系的p73基因与下游报告基因通过2A肽连接实现共表达。

优选地,所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、LOVO、HT29或DLD-1,进 一步优选为HCT116。

优选地,所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。

本发明的目的之二在于提供了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法,包括 以下步骤:

步骤1:p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估;

步骤2:构建pX459\/p73-sgRNA质粒;

步骤3:整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段;

步骤4:将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同 电击转化大肠癌细胞系HCT116;

步骤5:通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞,并扩增单克隆细胞系;

步骤6:筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定 p73报告基因细胞系。

优选地,步骤1中,设计并筛选出p73-sgRNA序列,所述p73-sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地,步骤2中,构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如下:根据所述p73-sgRNA的 序列,经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459\/p73-sgRNA。

优选地,步骤3中,整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下:根据p73 基因的同源重组序列和EGFP序列,经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R。

优选地,所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之三在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在肿瘤细胞发 生、发展或能量代谢研究中的应用。

优选地,所述肿瘤为大肠癌。

本发明的目的之四在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在细胞模型中 的应用。

优选地,所述细胞模型为肿瘤细胞模型,进一步优选为大肠癌细胞模型。

本发明的目的之五在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在研究p73基 因中的应用。

本发明的目的之六在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在筛选调控 p73基因变化的分子或药物中的应用。

优选地,所述药物为抗癌药物,优选地所述药物为抗大肠癌药物。

在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可以相互组合,得到具体实施方 式。

非另有具体的说明,本发明中所使用的技术和科学术语具有与本领域的技术人员 所理解的意义相同。本发明中使用的命名法和描述的实验方法是广泛所知的,并在本领域 中常用到的。

与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

(1)本发明经过层层筛选确定能够高效地靶向结合目标位点的p73-sgRNA,并直接 将构建好的质粒pX459\/p73-sgRNA与EGFP整合片段按一定比例共同电击转化大肠癌细胞系 HCT116中,确保了可以后续快速检测具EGFP表达的大肠癌p73报告基因细胞及建立稳定细 胞系的目的。

(2)本发明所述方法简单易行且高效,通过精心设计筛选的报告基因插入位点,利 用sgRNA精准定位基因位点快速获得目标基因插入的稳定细胞系,具有耗时少、成功率高的 优点。结果显示,EGFP敲进效率达到7-8%,本实验每96孔板可筛选7-10株,比本领域通常 1%的敲进效率有显著提高,而且该细胞系稳定传代30代后测序显示,基因敲进序列依然保 持遗传稳定。

(3)p73基因与报告基因EGFP通过自剪切肽2A肽连接,构建为一个操纵子,通过2A 肽的自我剪切功能保证了p73基因与EGFP的在细胞中能够共表达,互不干扰,实现了报告基 因对p73基因的示踪作用。

(4)本发明所述细胞系可进行实时监测,简易直观,将大大促进相关药物代谢评价 及相关基因功能的研究,极具临床推广潜力和应用价值。

附图说明

图1为绿色荧光蛋白靶基因敲入机理示意图。

图2为流式细胞仪筛选绿色荧光蛋白表达的单细胞克隆。

图3为筛选获得的阳性p73报告基因细胞系表达绿色荧光蛋白。

图4为PCR鉴定p73报告基因细胞系。

图5为免疫印迹法鉴定p73报告基因细胞系。

图6为shRNA敲减p73与EGFP的共同表达。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,以使本领域技术人员能够更好 地理解本发明并予以实施,但实施例并不作为本发明的限定。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂 等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1大肠癌p73报告基因细胞系的建立

步骤1:设计合适的p73-sgRNA序列,并进行评估:

通过筛选和评估,得到sgRNA序列,为:

p73-sgRNA:CGGAGGCCGAGATCCACTGA(>chr1:3733060-3733079),如SEQ ID NO.1

所示。

步骤2:构建pX459-sgRNA质粒,包括以下步骤:

根据p73-sgRNA的序列,经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒 pX459\/p73-sgRNA。

步骤3:整合L-EGFP-R片段,包括以下步骤:

根据p73基因的同源臂和EGFP序列,经生物公司合成后直接获得正确的整合片段 L-EGFP-R,序列如SEQ ID NO.2所示;构建流程如附图1所示。

步骤4:筛选具绿色荧光的大肠癌p73报告基因细胞系,包括以下步骤:

将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段L-EGFP-R按1:1的比例共 同电击转化大肠癌细胞系HCT116;

先用96孔板在流式细胞仪单细胞筛选(见图2),每个96孔板可获得7-10个具有 EGFP表达的细胞株,EGFP敲进效率达到7-8%,比本领域通常1%的敲进效率有显著提高。

扩增培养挑选的单克隆细胞系(见图3),提取并获得具有EGFP表达的细胞的基因 组DNA,进行基因组PCR,获得阳性扩增说明插入成功,为p73报告基因细胞系。PCR鉴定引物 序列如下所示:

正向引物F-GT:GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG,如SEQ ID NO.3所示;

反向引物R-GT:CCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC,如SEQ ID NO.4所示。

野生型细胞同样进行基因组PCR,PCR鉴定引物序列如下所示:

正向引物F-WT:GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG,如SEQ ID NO.5所示;

反向引物R-WT:GCTGCAGCCAGGCGAGGCCC,如SEQ ID NO.6所示。

通过PCR鉴定比对结果如图4所示,获得了4株p73报告基因细胞系;

最后再将筛选获得的EGFP表达的细胞通过免疫印迹方法进一步鉴定阳性p73基因 报告细胞系,鉴定结果如图5所示,最终获得了4株p73报告基因细胞系。

p73报告基因细胞系稳定传代30代后,测序显示,基因敲进序列依然保持遗传稳 定。

实施例2大肠癌p73报告基因细胞系的功能验证

设计2条不同的特异靶向p73基因小分子干扰RNA,如图6所示shRAN-1、shRAN-2,分 别转染p73报告细胞系,72小时后,转录水平分析显示相对于未敲减对照,两条特异小分子 干扰RNA均有效降低p73基因表达水平(大约敲减掉了70-80%);同时EGFP基因表达也随着 p73基因敲减而相应的降低了70-80%。该实验结果从分子水平证明了本发明构建的大肠癌 p73报告基因细胞系中报告基因EGFP与p73基因能够同步共表达,受到shRNA同步抑制,可以 用于p73基因的抑制或过表达的示踪。

最后应当说明的是,以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理 解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和 范围。

序列表

<110> 广东医科大学

<120> 一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

设计图

一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法论文和设计

相关信息详情

申请码:申请号:CN201910002839.1

申请日:2019-01-02

公开号:CN109777779A

公开日:2019-05-21

国家:CN

国家/省市:44(广东)

授权编号:CN109777779B

授权时间:20191008

主分类号:C12N 5/10

专利分类号:C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02

范畴分类:18H;

申请人:广东医科大学

第一申请人:广东医科大学

申请人地址:523808 广东省东莞市松山湖高新技术产业开发区新城大道1号

发明人:余红兵;刘欣;韩翠芳

第一发明人:余红兵

当前权利人:广东医科大学

代理人:黄秋云

代理机构:44486

代理机构编号:深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙)

优先权:关键词:当前状态:审核中

类型名称:外观设计

标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  

一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法论文和设计-余红兵
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