全文摘要
本发明公开了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，具体为：先设计p73基因位点特异性sgRNA序列，克隆进质粒PX459；整合p73基因同源重组序列以及绿色荧光蛋白DNA片段(EGFP)，将上述质粒和整合片段共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；筛选的EGFP表达细胞系通过PCR鉴定及免疫印迹验证阳性p73报告基因细胞系。该大肠癌细胞系p73基因和EGFP共同表达，其EGFP表达水平和p73基因具有高度一致性，故通过检测EGFP表达水平变化可以准确判断p73基因表达水平。本发明建立细胞系方法简单、易行、高效和精准定位基因位点。
主设计要求
1.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：步骤1：p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估；步骤2：构建pX459\/p73-sgRNA质粒；步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；步骤4：将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73报告基因细胞系；其中，所述步骤1中，设计并筛选出p73-sgRNA序列，所述p73-sgRNA的序列如SEQIDNO：1所示；所述步骤2中，构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如下：根据所述p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459\/p73-sgRNA；步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R；所述片段L-EGFP-R的序列如SEQIDNO.2所示。
设计方案
1.一种大肠癌p73报告基因细胞系，其特征在于，所述细胞系的p73基因与下游报告基 因通过2A肽连接实现共表达。
2.根据权利要求1所述的细胞系，所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、 LOVO、HT29或DLD-1，进一步优选为HCT116。
3.根据权利要求1所述的细胞系，所述报告基因通过CRISPR-Cas9技术转入p73基因下 游。
4.根据权利要求1所述的细胞系，所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。
5.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：
步骤1：p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估；
步骤2：构建pX459\/p73-sgRNA质粒；
步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；
步骤4：将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击 转化大肠癌细胞系HCT116；
步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；
步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73 报告基因细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤1中，设计并筛选出p73-sgRNA序列，所述p73- sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求5或6所述的方法，所述步骤2中，构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如 下：根据所述p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒 pX459\/p73-sgRNA；步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73 基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R； 所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法制备获得的细胞系。
9.权利要求1-4任一项所述的细胞系或权利要求8所述的细胞系在下述(1)-(4)中任一 的应用：
(1)在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用；
(2)在细胞模型中的应用
(3)在研究p73基因中的应用；或
(4)在药物筛选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述肿瘤为大肠癌；所述细胞模型为肿瘤细胞模型，优 选为大肠癌细胞模型；所述药物为抗癌药物。
设计说明书
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大肠癌p73报告基因细胞系及其建立方 法。
背景技术
报告基因是分子生物学研究领域中一种重要的工具，经常被用做标记所要研究的 目标基因，使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致，从而可以通过对报告 基因的表达来观察目标基因的表达调控。报告基因具有便捷、可靠、灵敏度高和高通量检测 等优点。目前常用到的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶和荧光蛋白等。作为无毒无害的 检测工具，荧光素酶和荧光蛋白在检测细胞基因表达方面占据着主导地位。
CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的成簇规律间隔短回文重复序列组成的适应性 免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。Cas蛋白有若干种，具有内切核酸酶活性。 CRISPR-Cas系统拥有三种类别，其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入、应用最成熟的一种类 别；其具有操作简便，作用位点选择灵活性强，活性高等优势。在人为设计的sgRNA的指导 下，表达的具有核酸内切酶活性的Cas蛋白会向基因靶点位置移动，最终结合于基因靶点处 发挥作用，当细胞基因组完整性被Cas蛋白酶破坏，细胞自身的自我修复系统便会被激活， 在带有基因组同源片段的外源目标基因存在的情况下，细胞则会以一定概率的同源重组方 式对自身基因组进行修复，从而实现外源基因的插入。
p73基因(Homo sapiens tumor protein p73，TP73，GenBank ID：NG_017035.2)是 p53转录因子家族的一员，p53基因家族还包括p53基因和p63基因。p73基因是Kaghad等研究 者于1997年筛选胰岛素介导的细胞信号转导因子时，在用对应IRS-1连接区的简并寡核苷 酸探针对COS细胞的cDNA文库进行杂交筛选，偶然发现了1个假阳性的cDNA克隆，序列与p53 基因有高度的同源性(Nature，1997.389:191-194.)。p73基因与p53基因所编码的蛋白质结 构与功能上差异不大，p73基因能以P53基因同样的方式激活p53的靶基因、诱导细胞凋亡并 抑制细胞生长(Clinical Cancer Research，2002.8(1)：165-170.)。许多研究者均提示p73 基因可能通过其静止基因的激活或过度表达参与部分肿瘤的形成(Cell Biology， 2007.178:283-296.)。近年来相关研究表明，p73基因表达水平相关于肿瘤分化，癌细胞分 化越低，该基因的表达越高(Molecular Cancer Research，2016.14(1)：56-65.)。综上所 述，p73基因的检测对肿瘤的诊断、分期及预后判断有重要的参考意义。
本研究关于大肠癌p73报告基因领域，利用CRISPR-Cas9技术构建了带有增强型绿 色荧光蛋白(EGFP)的大肠癌p73报告基因的细胞系，为p73基因及其信号通路的研究、相关 疾病致病机理的研究、药物筛选与评价工作提供了有利工具。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种大肠癌p73报告基因细胞系，其特征在于，所述细 胞系的p73基因与下游报告基因通过2A肽连接实现共表达。
优选地，所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、LOVO、HT29或DLD-1，进 一步优选为HCT116。
优选地，所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。
本发明的目的之二在于提供了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括 以下步骤：
步骤1：p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估；
步骤2：构建pX459\/p73-sgRNA质粒；
步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；
步骤4：将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同 电击转化大肠癌细胞系HCT116；
步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；
步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定 p73报告基因细胞系。
优选地，步骤1中，设计并筛选出p73-sgRNA序列，所述p73-sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，步骤2中，构建pX459\/p73-sgRNA质粒的方法如下：根据所述p73-sgRNA的 序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459\/p73-sgRNA。
优选地，步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73 基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R。
优选地，所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之三在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在肿瘤细胞发 生、发展或能量代谢研究中的应用。
优选地，所述肿瘤为大肠癌。
本发明的目的之四在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在细胞模型中 的应用。
优选地，所述细胞模型为肿瘤细胞模型，进一步优选为大肠癌细胞模型。
本发明的目的之五在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在研究p73基 因中的应用。
本发明的目的之六在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在筛选调控 p73基因变化的分子或药物中的应用。
优选地，所述药物为抗癌药物，优选地所述药物为抗大肠癌药物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方 式。
非另有具体的说明，本发明中所使用的技术和科学术语具有与本领域的技术人员 所理解的意义相同。本发明中使用的命名法和描述的实验方法是广泛所知的，并在本领域 中常用到的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明经过层层筛选确定能够高效地靶向结合目标位点的p73-sgRNA，并直接 将构建好的质粒pX459\/p73-sgRNA与EGFP整合片段按一定比例共同电击转化大肠癌细胞系 HCT116中，确保了可以后续快速检测具EGFP表达的大肠癌p73报告基因细胞及建立稳定细 胞系的目的。
(2)本发明所述方法简单易行且高效，通过精心设计筛选的报告基因插入位点，利 用sgRNA精准定位基因位点快速获得目标基因插入的稳定细胞系，具有耗时少、成功率高的 优点。结果显示，EGFP敲进效率达到7-8％，本实验每96孔板可筛选7-10株，比本领域通常 1％的敲进效率有显著提高，而且该细胞系稳定传代30代后测序显示，基因敲进序列依然保 持遗传稳定。
(3)p73基因与报告基因EGFP通过自剪切肽2A肽连接，构建为一个操纵子，通过2A 肽的自我剪切功能保证了p73基因与EGFP的在细胞中能够共表达，互不干扰，实现了报告基 因对p73基因的示踪作用。
(4)本发明所述细胞系可进行实时监测，简易直观，将大大促进相关药物代谢评价 及相关基因功能的研究，极具临床推广潜力和应用价值。
附图说明
图1为绿色荧光蛋白靶基因敲入机理示意图。
图2为流式细胞仪筛选绿色荧光蛋白表达的单细胞克隆。
图3为筛选获得的阳性p73报告基因细胞系表达绿色荧光蛋白。
图4为PCR鉴定p73报告基因细胞系。
图5为免疫印迹法鉴定p73报告基因细胞系。
图6为shRNA敲减p73与EGFP的共同表达。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好 地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1大肠癌p73报告基因细胞系的建立
步骤1：设计合适的p73-sgRNA序列，并进行评估：
通过筛选和评估，得到sgRNA序列，为：
p73-sgRNA：CGGAGGCCGAGATCCACTGA(>chr1:3733060-3733079)，如SEQ ID NO.1
所示。
步骤2：构建pX459-sgRNA质粒，包括以下步骤：
根据p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒 pX459\/p73-sgRNA。
步骤3：整合L-EGFP-R片段，包括以下步骤：
根据p73基因的同源臂和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段 L-EGFP-R，序列如SEQ ID NO.2所示；构建流程如附图1所示。
步骤4：筛选具绿色荧光的大肠癌p73报告基因细胞系，包括以下步骤：
将上述质粒pX459\/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段L-EGFP-R按1:1的比例共 同电击转化大肠癌细胞系HCT116；
先用96孔板在流式细胞仪单细胞筛选(见图2)，每个96孔板可获得7-10个具有 EGFP表达的细胞株，EGFP敲进效率达到7-8％，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高。
扩增培养挑选的单克隆细胞系(见图3)，提取并获得具有EGFP表达的细胞的基因 组DNA，进行基因组PCR，获得阳性扩增说明插入成功，为p73报告基因细胞系。PCR鉴定引物 序列如下所示：
正向引物F-GT：GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG，如SEQ ID NO.3所示；
反向引物R-GT：CCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC，如SEQ ID NO.4所示。
野生型细胞同样进行基因组PCR，PCR鉴定引物序列如下所示：
正向引物F-WT：GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物R-WT：GCTGCAGCCAGGCGAGGCCC，如SEQ ID NO.6所示。
通过PCR鉴定比对结果如图4所示，获得了4株p73报告基因细胞系；
最后再将筛选获得的EGFP表达的细胞通过免疫印迹方法进一步鉴定阳性p73基因 报告细胞系，鉴定结果如图5所示，最终获得了4株p73报告基因细胞系。
p73报告基因细胞系稳定传代30代后，测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳 定。
实施例2大肠癌p73报告基因细胞系的功能验证
设计2条不同的特异靶向p73基因小分子干扰RNA，如图6所示shRAN-1、shRAN-2，分 别转染p73报告细胞系，72小时后，转录水平分析显示相对于未敲减对照，两条特异小分子 干扰RNA均有效降低p73基因表达水平(大约敲减掉了70-80％)；同时EGFP基因表达也随着 p73基因敲减而相应的降低了70-80％。该实验结果从分子水平证明了本发明构建的大肠癌 p73报告基因细胞系中报告基因EGFP与p73基因能够同步共表达，受到shRNA同步抑制，可以 用于p73基因的抑制或过表达的示踪。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和 范围。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910002839.1
申请日:2019-01-02
公开号:CN109777779A
公开日:2019-05-21
国家:CN
国家/省市:44(广东)
授权编号:CN109777779B
授权时间:20191008
主分类号:C12N 5/10
专利分类号:C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02
范畴分类:18H;
申请人:广东医科大学
第一申请人:广东医科大学
申请人地址:523808 广东省东莞市松山湖高新技术产业开发区新城大道1号
发明人:余红兵;刘欣;韩翠芳
第一发明人:余红兵
当前权利人:广东医科大学
代理人:黄秋云
代理机构:44486
代理机构编号:深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙)
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计