铜绿假单胞菌蹭行运动与羧苄青霉素耐药相关性的研究

论文摘要

细菌对抗生素的耐药性日趋增强使得多重耐药菌株也在增多。作为院内感染的主要致病菌之一,铜绿假单胞菌的耐药菌株也频繁出现,这就使得现有的抗生素很难治愈这种细菌所引起的感染。运动性对于病原菌的定植以及出现耐药的主要原因之一的生物被膜的形成非常重要。前期研究发现,临床中分离的蹭行运动能力减弱的菌株多表现为对羧苄青霉素耐药,而部分与菌毛相关的基因突变后并未表现出抗生素抗性。因此本实验基于上述研究,进一步探讨菌体的蹭行运动与其对羧苄青霉素的耐药性之间是否具有一定的相关性?本论文通过两种方案进行研究:首先,构建与菌毛相关基因以及调控基因的突变体,直接确定蹭行运动相关的菌毛编码基因是否影响菌株对羧苄青霉素的抗性。其次,通过转座突变体库的构建,筛选蹭行运动明显降低且对羧苄青霉素敏感性发生变化的突变体,确定其是否是菌毛相关的基因。研究中选择了pilPONM、pilQ、pilF、pilT、fimV、pilK、pilRS、cpdA等13个基因或操纵子进行敲除,通过测定相关表型以及透射电子显微镜观察发现:编码菌毛的结构基因cpdA对羧苄青霉素变得敏感,但是蹭行运动能力未发生显著变化。其余菌毛相关基因突变后蹭行运动能力都显著降低,但是其对羧苄青霉素的敏感性未发生明显改变。此外,实验中也检测了菌株对其它16种抗菌药物的敏感性,结果显示只有cpdA突变体的敏感性发生变化。运用转座突变技术我们构建了覆盖基因组6倍左右的转座突变体文库,包含41000个单克隆。筛选获得21株蹭行运动和羧苄青霉素同时有显著变化的转座突变体,此外测定了其它16种抗菌药物的敏感性,结果显示:这些转座突变体对检测的抗菌药物表现出与羧苄青霉素一样的敏感程度,测序分析表明其基因没有已知的与Ⅳ菌毛相关的基因。同时构建其中的dsbA、wbpL、crC基因的敲除突变体,验证其表型与转座突变体一致。最后结合文献报道对这三个基因编码的蛋白通过软件进行蛋白互作的预测,其中DsbA、CrC被报道均与PilA有关。因此dsbA、wbpL、crC可能在全基因组上是全局调控子而且也是潜在的与Ⅳ菌毛有关的基因。通过研究表明菌毛合成相关基因突变后菌体的蹭行运动发生变化与其对羧苄青霉素的耐药性并不存在直接的关系,可能菌体的蹭行运动发生变化只是菌体对抗生素的抗性发生变化时表现出的其中的一种表型,具体的作用机制还有待进一步研究;此外研究也发现dsbA、wbpL、crC可能是潜在的与菌毛相关的基因,这就为Ⅳ菌毛的基因家族提供了新的成员,为更好的探究菌毛的作用机理提供新线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略表
• 第一章 绪论
•   1.1 铜绿假单胞菌
•     1.1.1 铜绿假单胞菌简介
•     1.1.2 铜绿假单胞菌的致病性
•     1.1.3 铜绿假单胞菌的耐药机制
•     1.1.4 铜绿假单胞菌的Ⅳ菌毛与蹭行运动
•   1.2 抗生素
•     1.2.1 抗生素的发现与发展
•     1.2.2 抗生素的作用机理
•     1.2.3 抗生素的使用现状
•   1.3 抗生素与运动性的研究进展
•   1.4 本课题研究的内容和目的及意义
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验所用菌株和质粒以及引物列表
•     2.1.2 实验所用培养基、缓冲液的配制
•     2.1.3 实验所用试剂
•     2.1.4 实验所用仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 质粒DNA的小量提取
•     2.2.2 质粒和基因等的纯化
•     2.2.3 E.coli10B感受态细胞的制备
•     2.2.4 目的基因片段的获取
•     2.2.5 聚合酶链式反应（PCR）
•     2.2.6 酶切和连接反应
•     2.2.7 电转化
•     2.2.8 三亲株实验
•     2.2.9 基因敲除
•     2.2.10 随机转座突变体的构建
•     2.2.11 细菌的蹭行运动
•     2.2.12 与细菌的蹭行运动相关的转座突变体的筛选
•     2.2.13 与细菌对羧苄青霉素的耐药性相关的转座突变体的筛选
•     2.2.14 液体测定菌株对Cb的最小抑制浓度（MIC）
•     2.2.15 随机引物PCR
•     2.2.16 随机PCR过程以及转座子插入位点的确定
•     2.2.17 透射电子显微镜（TEM）观察菌体Ⅳ菌毛
•     2.2.18 细菌的泳动（swimming）与丛动（swarming）
• 第三章 实验结果
•   3.1 与T4P有关的基因的突变体的检测
•     3.1.1 与Ⅳ菌毛相关的部分基因的缺失突变体的构建
•     3.1.2 T4P相关的基因缺失突变体的蹭行运动
•     3.1.3 T4P相关基因的缺失突变体的Cb抗性表型
•     3.1.4 T4P相关基因的缺失突变体对其它16 种抗生素或抗菌药的抗性检测
•     3.1.5 透射电子显微镜（TEM）观察T4P相关基因的突变体的形态
•   3.2 随机转座突变体的研究
•     3.2.1 与蹭行运动有关的随机转座突变体库的构建
•     3.2.2 同时影响蹭行运动和羧苄青霉素的转座突变体的筛选
•     3.2.3 转座突变体对其它16 种抗生素或抗菌药的抗性检测
•     3.2.4 转座子插入基因位点的确定
•     3.2.5 PA5489和PA3145 以及PA5332 基因的相关信息
•     3.2.6 dsbA和 wbpL以及crC基因缺失突变体的构建
•     3.2.7 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的蹭行运动
•     3.2.8 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC对 Cb及其它16 种抗生素或抗菌药的抗性检测
•     3.2.9 透射电子显微镜（TEM）观察ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的形态
•     3.2.10 与DsbA和 WbpL以及Crc有相互作用的蛋白的预测
•     3.2.11 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的泳动及丛动观察
• 第四章 总结与讨论
•   4.1 铜绿假单胞菌Ⅳ菌毛相关基因的研究
•   4.2 铜绿假单胞菌随机转座突变的研究
• 参考文献
• 硕士学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 闫蓉

导师: 段康民

关键词: 铜绿假单胞菌,耐药性,抗生素,蹭行运动,菌毛,羧苄青霉素

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 西北大学

分类号: Q78;R378

总页数: 83

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