论文摘要
1研究背景与目的Wip1（Wild-type p53-induced phosphatase 1）属于蛋白磷酸酶PP2C家族,通过去磷酸化p53和p38 MAPK等促进癌症的发生发展,Wipl在乳腺癌和肺癌等许多肿瘤中都存在着高表达的现象。然而通过前期实验和查阅文献,课题组却发现抑制Wipl后肝脏再生加快,已有研究证实Wipl基因敲除小鼠的肝脏再生速度明显增快。如果存在针对Wipl靶点的促进肝再生的药物,将会对活体肝移植和肝大部切除的患者提供很大的帮助。本研究通过2/3肝切除小鼠,研究Wipl磷酸酶抑制剂GSK2830371对小鼠肝脏再生以及再生中有氧糖酵解的影响;进一步研究GSK2830371对人正常肝细胞系L02的影响。2实验方法2.1动物实验选取40只7-8周体重为22.5-24 g的C57BL6/J雄性小鼠,随机分为两组,饲养于SPF级环境中。将GSK2830371溶解于DMSO,实验组腹腔注射lmg GSK2830371,对照组注射等体积的DMSO。无菌条件下将所有小鼠2/3肝切除,术后同样方法隔天给药一次。不同时间点处死各组小鼠3-4只,小心取出老鼠肝脏,肝脏/体重比和BrdU免疫组化检测肝脏再生情况。2.2细胞实验将L02肝细胞培养于10%胎牛血清DMEM高糖培养基中,细胞生长环境为37℃ 5%C02的湿润培养箱。代谢实验前12h,取细胞均匀种植在6、12或96孔板中,使用不含血清的DMEM饥饿处理。实验时使用含GSK2830371的DMEM处理实验组细胞,等体积的DMEM处理对照组细胞。2.3葡萄糖和乳酸含量测量于不同时间点收集上层培养基;低温超声法提取新鲜小鼠肝脏的组织匀浆。酶学比色法试剂盒检测葡萄糖和乳酸的含量。2.4细胞内ATP水平检测于不同时间点收集细胞,提取细胞裂解液。化学发光法检测细胞中ATP的水平。2.5线粒体活性检测根据CCK-8的原理,OD值表示整体的线粒体活性,用不同浓度的GSK2830371刺激L02细胞,CCK-8检测细胞的线粒体活性。2.6流式细胞技术使用流式细胞技术PI染色检测GSK2830371对L02细胞周期的影响。2.7关键酶活性的测量于不同时间点收集细胞,取新鲜小鼠肝脏组织,提取蛋白质,酶学比色法试剂盒检测细胞和肝组织中糖酵解关键酶HK、PFK、PK和LDH的酶活性。2.8 QRT-RCR于不同时间点收集细胞,提取RNA,QRT-RCR检测细胞中HIFlα、PDK1、GLUT1和MCT4的mRNA表达情况。2.9 Western blot于不同时间点收集细胞,提取两组细胞蛋白质,western blot检测糖酵解相关蛋白的表达情况。2.10免疫组化使用免疫组化BrdU染色法检测两组小鼠肝脏再生情况。3结果3.1小鼠肝部分切除后,GSK2830371能促进肝脏再生。小鼠肝部分切除后,经GSK2830371治疗小鼠的ILBW（Cindex of liver to body weight）比对照组小鼠的高。免疫组化也显示,在GSK2830371治疗小鼠的肝组织中,BrdU染色阳性的细胞数目比对照小鼠肝组织中的多。3.2小鼠肝部分切除后,GSK2830371能提高小鼠肝脏的有氧糖酵解水平。两组小鼠的新鲜肝脏组织样本检测结果表明,GSK2830371治疗组小鼠肝组织中的乳酸水平高于对照组。小鼠肝切除后36h和48h,GSK2830371治疗组小鼠肝组织PFK、HK和LDH的酶活性也高于对照组小鼠,PK的酶活性没有明显差异。3.3 GSK2830371能提高L02肝细胞的有氧糖酵解水平并抑制细胞的线粒体有氧呼吸。经GSK2830371刺激细胞的葡萄糖消耗量和乳酸产量高于对照组,相应的GLUT1和MCT4的mRNA表达量高于对照组。经GSK2830371刺激的细胞的线粒体的活性明显低于对照组,相应的细胞内ATP水平低于对照组。经GSK2830371刺激细胞的糖酵解关键酶HK、PFK和LDH的酶活性均高于对照组。3.4 GSK2830371部分通过mTOR/HIFlα途径提高L02肝细胞的有氧糖酵解水平。经GSK2830371刺激细胞的mTOR蛋白表达量及其磷酸化水平明显高于对照组。已有很多研究证明激活的mTOR可以通过HIFlα途径提高糖酵解水平,进一步QRT-PCR证实了mTOR下游的HIFlα、PDK、GLUTl 和 MCT4的mRNA表达量均有不同程度的增加,HK2蛋白表达量也轻微增加。其中,PDK能磷酸化丙酮酸脱氢酶进而导致其活性的降低,GLUT1能促进细胞对葡萄糖的吸收,MCT4能促进细胞对乳酸的排泄。4结论Wipl磷酸酶抑制剂GSK2830371能够促进肝脏的再生并能提高肝脏细胞有氧糖酵解的水平;GSK2830371部分通过mTOR/HIFlα途径促进肝细胞有氧糖酵解的提升。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张鹏
导师: 刘军
关键词: 抑制剂,肝再生,有氧糖酵解
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 山东大学
分类号: R333.4
总页数: 52
文件大小: 3123K
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