罗德全（哈药集团制药六厂150056）
【摘要】双黄连口服液，主要成分是金银花、黄芩、连翘，本品具有疏风解表、清热解毒的功效，用于外感风热所致的感冒，症见发热、咳嗽、咽痛。中药制剂成分复杂在同一色谱条件下有许多杂质峰干扰主峰检测，使色谱图的主峰面积比实际峰面积大。造成样品浓度虚高的现象。按药典规定的方法，测定绿原酸含量检验周期长，准确度较低。本实验通过改善色谱分离条件，提高高效液相色谱法测定双黄连口服液绿原酸测定准确度。
【关键词】双黄连口服液绿原酸HPLC法
【中图分类号】R927.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）35-0119-02
1试剂和仪器
试剂：水、甲醇、冰醋酸；仪器：:岛津LC-20A高效液相色谱仪，梅特勒X205电子天平。
2方法与结果
2.1色谱峰不纯有两个原因及解决措施：（1）样品本身杂质峰未和主峰完全分离，解决措改变柱温，延长保留时间。（2）一针样品的杂质未在分析时间内洗脱下来，而在下一针分析时间内洗脱下来，和待测组分峰包裹在一起，解决措施：提高色谱分析的效率。
2.2通过优化色谱分离条件，可提高色谱分离的初始理论塔板数，进而提高色谱分析的准确度，并提高色谱柱使用寿命。可通过改变柱温，更换色谱柱，改变流动相有机相的比例，进样量来达到目的。经过实验过对改变流动相中有机相的比例、更换高校色谱柱、增加样品分析时间、进行梯度洗脱的研究，发现主要是改变柱温、进行梯度洗脱影响较大。
2.3经实验得知，柱温这一色谱条件是决定色谱分离的决定因素，且32℃为最佳实验温度。
2.4由于绿原酸在18分钟已经从色谱柱中洗脱下来，而最后一个组分则要80分钟才能吸脱下来，根据反相色谱分离原理，可以减小溶剂（流动相）极性来加速组分的洗脱。流动相的极性是将保证绿原酸良好分离和杂质快速洗脱的关键点。
2.5在绿原酸出峰以前保持流动相为水-甲醇比例为80：20，在19分钟时调节流动相比例为100%甲醇。经试验得知在流动相换成100%甲醇8分钟后基线变得平稳，表示不关心的组分已经完全洗脱下来，在27分钟时将流动相在调回水-甲醇（80：20）。重新平衡色谱柱，监控检测器SAMP池能量，经过8分种后能量值恢复到初始状态。表明理论上可以进下一个样品继续分析了。这样就将原来的分析时间由80分钟缩短为40分钟了。
2.6线性范围试验。取经减压干燥12小时的绿原酸对照品，精密称定，加水溶解转容后，分别制成浓度为7.984、15.968、23.952、31.936、39.92、47.904、55.8888、63.872、71.856、79.84μg/ml的溶液，进样10?l，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标经回归，得线性回归方程Y=3.868713e-008X，线性相关系数γ=0.99999。结果表明：绿原酸在7.984-79.84μg/ml范围内，浓度同峰面积呈良好的线形关系。
2.7最小检出量。精密量取线性项下的7.984μg/ml浓度的对照品溶液1ml，置于量瓶中，进样10?l,色谱分析显示，信噪比大于3，故最小检出量应为0.27μg/ml。
2.8稳定性。取同一批双黄连口服液按已确定的色谱条件连续进样6次。结果RSD为0.17%，小于2.0%，符合要求。
2.9重复性。取绿原酸对照液，按上述色谱条件连续进样6次。样品的实际浓度39.92μg/ml，6次样品的检验平均浓度39.9215μg/ml，检验浓度结果的相对标准差RSD0.002%（<2.0%），符合要求。
2.10回收率试验。以已知含量的样品为基液，加入对照品，做加样回收率试验，平均回收率为99.97%，RSD0.07%（<2.0%），表明方法准确结果可靠。
2.11样品稳定性考察。取口服液样品，分别在0、2、4、6、8、10小时后按上述色谱条件进样分析，RSD0.24%（<2.0%），得出样品溶液在10小时内相当稳定。
3讨论
通过改变色谱试验柱温为32℃，使用色谱柱使柱效提高为8000，大大高于要变标准6000，经过1000次试验理论塔板数还维持在7000。通过两种洗脱方式相结合，大大缩短了样品的分析时间由原来的80分钟缩短为40分钟。经过方法学研究新方法样品浓度在10ug/ml~100ug/ml范围内浓度与峰面积呈一次过原点线性关系，相关系数0.99999。选同批样品制成六分样品，结果相对标准偏差0.17%<2%(国家标准)。选已知浓度的绿原酸对照液连续进样６次，结果相对标准偏差0.002%。取同批样品按《中国药典附录》做加样回收试验回收率为99.97%。口服液样品，分别在0、2、4、6、8、10小时后按上述色谱条件进样分析，得出样品溶液在10小时内相当稳定。
参考文献
[1]刘晶.张燕丽.付起凤.康毅华金银花最佳采收期的研究，中医药信息2011(3)