不同Na+离子强度下菌藻团聚过程表征及机制研究

论文摘要

光合自养藻类和异养型细菌是自然环境中重要的初级生产者和消费者。这两种类型微生物间的相互作用对水生及陆地系统的元素循环,生态健康等方面具有重要意义。在自然环境中,这两种微生物常常相互粘附形成多细胞团聚体。在团聚体内,细胞间紧密的接触促进了物种间相互作用。因此,藻类和细菌的团聚过程对于其生长代谢及相关环境生态功能起到重要作用。前人对于菌藻互作的研究多集中于从整体功能角度出发,探究共存条件下微生物生长速率、养分循环、代谢产物、基因表达的特点,对菌藻团聚过程及其决定因素研究甚少。离子强度是决定微生物界面反应的主要环境因子之一,因此本文主要研究不同离子强度（1 mM NaCl、10 mM NaCl、100 mM NaCl）条件下细菌E.coli K12 和藻类 团聚过程的差异,借助倒置荧光显微镜（FM）、激光共聚焦显微镜（CLSM）、扫描电镜（SEM）等表征动态团聚过程;采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、接触角测量仪、Zeta电位仪等分析技术,结合生物学研究方法（突变株构建、EPS提取和分析、酶处理团聚体等）阐明菌藻的团聚机制。本研究的主要结果如下:（1）利用显微技术原位观测菌藻互作团聚,发现不同离子强度下互作具有较大差异。在离子强度为1 mM NaCl、100 mM NaCl时未发现明显的团聚现象,菌藻互作呈分散、均匀态分布;在10 mM NaCl环境下菌藻互作多呈密集、团聚态分布,该吸附团聚现象为大量细菌细胞在藻类细胞表面直接吸附或藻类细胞周围形成团聚体。该团聚会加快衣藻生长速率。（2）基于傅里叶转换红外光谱（ATR-FTIR）、接触角测量仪、Zeta电位仪等界面反应的传统研究技术手段表征不同离子强度下菌藻互作表面性质。明确菌藻互作吸附团聚的界面反应作用机理不同于微生物-固体界面。前人研究大肠杆菌与土壤矿物间吸附随着离子强度（0 mM NaCl-100 mM NaCl）的增大而增加,随zeta增大而增大。在菌藻互作中虽然不同离子强度菌藻的zeta电位值变化趋势与细菌-固体界面反应一致,但是吸附团聚现象却发生在10 mM NaCl环境下,说明在不同环境离子强度中菌藻互作过程有更重要的物质或作用力起主导作用。（3）结合基因敲除、EPS提取和分析、酶处理团聚体生物学研究方法揭示了菌藻互作团聚机制。通过对菌藻互作团聚体的酶处理及藻类EPS定量分析,研究结果表明蛋白酶处理团聚体解体率高达95%,用酶前处理的藻与细菌互作无法形成团聚体,此外藻类细胞表面紧密结合态EPS中,10 mM NaCl团聚环境下蛋白含量是100 mM NaCl非团聚环境蛋白含量的三倍,充分证明藻类细胞表面分泌紧密结合态蛋白是形成团聚的主要驱动因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 菌藻互作在自然环境中重要性
•   1.2 菌藻互作类型
•     1.2.1 互利共生
•     1.2.2 偏利共生
•     1.2.3 寄生
•   1.3 菌藻互作机理
•   1.4 菌藻互作与团聚的热区:藻际微环境
•   1.5 环境因素对微生物细胞团聚的影响
•     1.5.1 微生物细胞的界面作用力
•     1.5.2 环境因素对界面吸附作用的影响
•     1.5.3 EPS在界面吸附反应中的重要性
•   1.6 实验菌株简介
•     1.6.1 E.coli K12
•     1.6.2 C.reinhardtii
•   1.7 研究目的及内容
• 2 材料方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验菌株
•     2.1.2 培养液
•     2.1.3 缓冲液
•   2.2 E.coli K12与C.reinhardtii细胞个数与吸光度（OD）标准曲线
•     2.2.1 E.coli K12标准曲线
•     2.2.2 C.reinhardtii标准曲线
•   2.3 E.coli K12绿色荧光标记
•     2.3.1 质粒提取步骤
•     2.3.2 质粒的电化学转化法
•     2.3.3 E.coli K12绿色荧光标记对生长影响
•   2.4 E.coli K12与C.reinhardtii互作团聚过程表征
•     2.4.1 菌藻互作团聚过程的荧光显微镜观察
•     2.4.2 Image J处理图像定量表征互作程度
•   2.5 菌藻互作的生长表征
•     2.5.1 不同电导率生长培养基TP的配制
•     2.5.2 菌藻互作生长的荧光显微镜观察
•     2.5.3 互作生长中藻含量测定
•   2.6 菌藻互作团聚体的扫描电镜观察
•   2.7 菌藻互作吸附团聚机制探究
•     2.7.1 zeta potential分析
•     2.7.2 不同离子强度下菌藻表面疏水性测定
•     2.7.3 作用能的扩展DLVO理论计算
•     2.7.4 衰减全反射傅里叶红外光谱分析
•     2.7.5 不同比例菌藻互作对团聚影响
•     2.7.6 互作菌藻的酶处理
•   2.8 E.coli K12趋向运动性对菌藻团聚的影响
•     2.8.1 E.coli K12-△motA /△cheA突变株构建
•     2.8.2 突变株△motA、△cheA运动性分析
•     2.8.3 突变株△mnotA、△cheA与C.reinhardtii互作团聚表征
•   2.9 胞外紧密结合态EPS（B-EPS）蛋白多糖组分测定
•     2.9.1 阳离子树脂交换法（CER）提取B-EPS
•     2.9.2 B-EPS中蛋白多糖含量测定
•   2.10 数据分析
• 3 结果
•   3.1 E.coli K12与C.reinhardtii细胞数与吸光值OD关系
•   3.2 E.coli K12及E.coli K12:GFP （pBS-EGFP）生长曲线
•   3.3 菌藻互作团聚表征
•   3.4 菌藻互作团聚定量分析
•   3.5 菌藻互作团聚CLSM及SEM表征
•   3.6 团聚体促进C.reinhardtii生长
•   3.7 不同离子强度下菌藻傅里叶变换红外表征
•   3.8 不同离子强度下菌藻的表面性质
•   3.9 菌藻比例影响团聚体形成
•   3.10 E.coli K12突变株（△motA、△cheA）对团聚体形成影响
•   3.11 菌藻团聚体酶处理
•   3.12 藻际微环境EPS蛋白多糖含量
• 4 讨论
•   4.1 不同环境离子影响菌藻互作在液体环境空间分布
•   4.2 藻际微环境中菌藻吸附团聚影响
•   4.3 离子强度对菌藻团聚影响
•   4.4 酶处理团聚体
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 辛月星

导师: 蔡鹏

关键词: 菌藻互作,细胞团聚,胞外聚合物,离子强度,生物膜

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中农业大学

分类号: Q948.122.3

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000834

总页数: 76

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