一种预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法的敏感性的方法论文和设计-张史钺

全文摘要

本发明公开了以KMT2C和TP53这两个基因作为生物标志物来预测癌症（非小细胞肺癌）患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的方法；还公开了特异性检测所述生物标志物的试剂在制备预测癌症患者（非小细胞肺癌）对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的试剂盒中的用途。在本发明中，通过组合考虑TP53和KMT2C基因突变状态，能够准确预测NSCLC患者中对ICI敏感的群体，避免盲目用药，提高ICI治疗的经济性能。

主设计要求

1.特异性检测TP53基因突变和特异性检测KMT2C基因突变的试剂在制备用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法的敏感性的试剂盒或装置中的用途。

设计方案

1.特异性检测TP53基因突变和特异性检测KMT2C基因突变的试剂在制备用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的试剂盒或装置中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述预测包括如下步骤，

步骤a)评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变；和

步骤b)评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变；和

步骤c)基于a)、b)的评估结果预测癌症患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述评估是指，比较肿瘤组织与对照组织的测序数据评估所述TP53基因突变和KMT2C基因突变。

4.一种用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的试剂盒，其特征在于，由特异性检测TP53基因突变和特异性检测KMT2C基因突变的试剂组成。

5.一种用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的装置，其特征在于，所述装置包括以下三个模块：

评估模块I)，其评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变；

评估模块II)，其评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变；和

预测模块III)，其基于评估模块I)、II)的评估结果预测癌症患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

6.一种用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的装置，其特征在于，所述装置包括：存储器，用于存储程序；处理器，用于通过执行上述存储器存储的程序以实现预测癌症患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性，所述预测包括如下步骤，

步骤a)评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变；和

步骤b)评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变；和

步骤c)基于a)、b)的评估结果预测癌症患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

7.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其包括程序，该程序能够被处理器执行以实现预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的全部步骤，所述全部步骤包括，

步骤a)评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变；和

步骤b)评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变；和

步骤c)基于a)、b)的评估结果预测癌症患者对使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

设计说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的方法、试剂盒和系统。更具体而言，本发明涉及使用KMT2C基因和TP53基因作为生物标志物来预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

背景技术

临床将肺癌分为两大类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。这种区分是相当重要的，因为对这两种类型的肺癌的治疗方案是截然不同的。鉴别两种分型，是需要通过支气管镜、穿刺活检或是术后获得病理，经过病理科医生诊断才能确定。非小细胞肺癌是相对于小细胞肺癌而言，实际是一大类疾病的总称，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等。现在临床已经越来越少的使用这个称谓，更多直接用鳞癌、腺癌等名称。其中鳞癌最为常见，约占50%，生长速度比较缓慢，病程较长，对放化疗相对较敏感。腺癌女性相对多见，一般生长较慢，但有时早期即发口发生血行转移。非小细胞肺癌在其早期阶段多可以通过手术获得根治，较少复发。局部晚期的非小细胞肺癌多采用多学科的手段来治疗，需要胸外科、放疗科、内科的医生讨论后制定适合于患者的治疗方案。部分患者也可以获得治愈。对于多数转移性肺癌，以全身治疗为主。其中部分患者的治疗效果较好，可以使患者获得长期生存，例如，对于ALK阳性肺癌，现在经过治疗后大约50%的患者生存时间超过4年。小细胞肺癌约占20%左右，属于神经内分泌癌，常伴内分泌异常或类癌综合征，是一种恶性程度很高的肿瘤，多位于肺中央部，生长迅速，较早出现转移。对于初始的化疗或放疗多非常敏感，但大多数患者很快出现耐药，一旦耐药，后续治疗较困难。小细胞肺癌分为局限期及广泛期，局限期小细胞肺癌强调开始化疗后尽早联合放疗；广泛期多在化疗结束后部分患者可以行胸部放疗。

而肿瘤免疫治疗现已发展得如火如荼，其中免疫检查点抑制剂（抗PD-1\/PD-L1抑制剂）更是近年肿瘤治疗领域的“明星”药物，已进入非小细胞肺癌一线治疗。但是我们也要看到虽然免疫检查点抑制剂效果不错，但整体ORR依然只有20%左右，所以如何精准筛选获益人群成为临床医生迫切需要解决的问题。

PD-L1,TMB（肿瘤突变负荷，tumor mutational burden）以及MSI（微卫星不稳定，microsatellite instability）是三个获得FDA认可或NCCN指南推荐的免疫治疗生物标志物（biomarker），但是这三个生物标志物各有优缺点。PD-L1作为免疫治疗biomarker应用最为广泛，PD-L1 IHC检测也被FDA获准作为Pembrolizumab一线用药的伴随诊断。但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，且持续缓解时间并不逊于PD-L1阳性患者；TMB同样是非小细胞肺癌NCCN指南推荐的免疫治疗biomarker，但是鉴于不同公司或实验室对于TMB算法的不同，TMB阈值难以建立共识；MSI已经作为肿瘤关键biomarker让FDA同意基于MSI状态，而不是组织病理类型，进行用药治疗，但是肿瘤中MSI-H比例太低，临床推广有一定局限性。最重要的一点就是现有研究（纳入11348例实体瘤）发现，PD-L1阳性、TMB高表达以及MSI-H三者重叠率仅为0.6%，提示任一biomarker单用都会遗漏很多潜在免疫治疗获益人群。所以需要进一步探索免疫治疗biomarker。

随着二代测序在肿瘤精准治疗中的开展日益广泛，特定基因的体细胞突变被发现可能影响肿瘤免疫功能或对免疫治疗的响应，即提示特定体细胞突变可能是潜在的免疫治疗预测因子。EGFR突变和ALK重排是ICI免疫治疗不良预后的潜在预测因子。一项回顾性分析发现，这些患者中只有3.6%对ICI免疫治疗有反应，而EGFR野生型和ALK阴性或未知患者的反应率为23.3%。对包括使用PD-(L)1抑制剂治疗的3025名晚期NSCLC患者的5项试验进行的荟萃分析发现，在EGFR突变的患者中，与多西他赛相比，总体生存率没有改善。EGFR突变或ALK重排的肺癌显示较低的PD-L1和CD8^{+<\/sup>T细胞浸润，这可能是ICI免疫治疗反应不佳的原因。除了EGFR和ALK的改变、TP53和KRAS的协同突变以及同源重组修复和错配修复(HRR-MMR)或HRR和碱基切除修复(HRR-BER)的DNA损伤反应(DDR)通路中的协同突变被认为是ICI免疫治疗疗效较好的正向预测因子，而KRAS和STK11的协同突变与ICI免疫治疗不良预后有关。但是以上这些基因突变作为biomarker依然不能覆盖所有潜在免疫治疗获益人群，本领域仍然需要更高效、更准确地鉴定适用于免疫检查点抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者的方法和工具。}

PD-L1和TMB已被认为是用于选择对ICI治疗敏感的NSCLC患者的2个最常用预测生物标志物。然而，PD-L1检测由于不同抗PD-(L)1药物都有各自对应的PD-(L)1检测抗体和平台，导致缺乏统一的标准；另外PD-L1的表达具有动态变化的特点，导致PD-L1表达与免疫治疗效果之间的关系仍有一些争议；另一方面，虽然大量随机对照研究和大样本真实世界研究都已证实TMB与免疫疗效之间的相关性，但是TMB依然只能反映肿瘤突变数量，而不能提示肿瘤微环境的状态，且TMB检测对技术平台要求较高，工作周期较长，成本较高都制约其临床应用。因此，急需一种能够高效的对免疫疗法敏感性的预测方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了KMT2C基因和TP53基因作为生物标志物来预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的方法及试剂盒，及装置和系统。

本发明所述的KMT2C基因序列如GenBank登录号NG_033948.1所示，本发明所述的TP53基因序列如GenBank登录号NG_017013.2所示。

在第一方面，本发明提供了特异性检测TP53基因突变和\/或表达水平、和\/或特异性检测KMT2C基因突变\/或表达水平的试剂在制备用于预测癌症患者对免疫疗法的敏感性的试剂盒或装置中的用途。

在一些实施方案中，所述免疫疗法为使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法。

在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌（NSCLC）。

在一些实施方案中，所述试剂例如基因组测序试剂、基因特异性引物或探针、基因表达产物的特异性抗体等。

在第二方面，本发明提供了一种用于预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的方法，所述方法包括

步骤a) 评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变和\/或表达；和

步骤b) 评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变和\/或表达；和

步骤c) 基于a)、b)的评估结果预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌（NSCLC）。

如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。本领域已知多种可用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂。例如，本发明所述免疫检查点抑制剂包括但不限于PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，例如国内的特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗，以及派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、Avelumab以及Durvalumab。

在本发明各个方面的一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

在本发明各个方面的一些实施方案中，通过比较肿瘤组织与对照组织的测序数据，例如基因组测序数据和\/或外显子组测序数据评估所述TP53基因突变和KMT2C基因突变。

在本发明各个方面的一些实施方案中，所述对照组织是来自所述对象的正常组织(非肿瘤组织)，例如血液组织。

在本发明各个方面的一些实施方案中，所述测序是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用本发明的NGS的测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche\/454 FLX、Illumina\/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLID system等。

外显子组测序是利用序列捕获技术将基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于它具有对常见和罕见变异高灵敏度，因此仅需对2%的基因组进行测序就能发现外显子区域的大部分疾病相关变异。所述测序可以是全基因组测序，也可以覆盖基因组中部分基因或区域的测序。

在一些实施方案中，评估TP53基因突变包括确定其编码区是否存在突变，例如移码突变。在一些实施方案中，所述突变位于TP53基因的285-864位核苷酸、954-1074位核苷酸内。在一些优选实施方案中，评估TP53基因突变包括确定其编码区是否存在使TP53蛋白截短的突变。

在一些实施方案中，通过转录组测序、聚合酶链反应(PCR)或免疫测定评估TP53基因表达。本领域已知各种可以检测具体基因表达的方法，这些都可以应用于本发明。

例如，转录组测序是通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。此外，通过设计合适的引物，可以通过PCR如逆转录PCR测定TP53基因的转录表达水平。此外，还可以使用TP53蛋白特异性抗体，通过免疫测定例如免疫组化(IHC)、ELISA等方法测定TP53基因的蛋白表达水平。

在一些实施方案中，在确定TP53基因编码区存在使TP53蛋白截短的突变后，评估TP53基因表达，例如TP53基因的蛋白表达水平。

在一些实施方案中，评估KMT2C基因突变包括评估其编码区是否存在突变。

在一些实施方案中，所述KMT2C基因突变是导致高肿瘤突变负荷(TMB)的突变。肿瘤突变负荷(TMB)被定义为每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。TMB一般以突变的总数量或每1Mb (1兆碱基)的突变数量来表示(muts\/Mb)。

在一些实施方案，所述突变位于KMT2C基因的3999-7788位核苷酸、9375-13071位核苷酸内。在一些优选实施方案中，评估KMT2C基因突变包括确定其编码区是否存在使KMT2C蛋白截短的突变。

在一些实施方案中，如果i)TP53基因存在突变和\/或TP53基因表达缺失，且ii)KMT2C基因存在突变和\/或KMT2C基因表达缺失，则预测所述患者对所述免疫治疗敏感。

在一些实施方案中，如果i)TP53基因不存在突变和\/或TP53基因表达完整，且ii)KMT2C基因存在突变和\/或KMT2C基因表达缺失，则预测所述患者对所述免疫治疗不敏感。

在一些实施方案中，如果i)TP53基因不存在突变和\/或TP53基因表达完整，且ii)KMT2C基因不存在突变和\/或KMT2C基因表达完整，则预测所述患者对所述免疫治疗不敏感。

在一些实施方案中，所述方法包括从所述癌症患者获取所述肿瘤组织的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括对所获取的肿瘤组织进行质量检测的步骤。

在一些实施方案中，通过从提取自所述肿瘤组织的核酸扩增ACTIN基因来进行所述质量检测。在一些实施方案中，使用以下三组引物对扩增ACTIN基因：

i) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’（SEQ ID NO:1）和5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’（ SEQ ID NO:2），

ii) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’ （ SEQ ID NO:1）和5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’ （ SEQ ID NO:3），和

iii) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’ （ SEQ ID NO:1）和5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’ （ SEQ ID NO:4），其分别扩增100bp、200bp和300bp的片段。当三组引物均扩增到目的片段时判定肿瘤组织质量合格。

通过上述步骤对肿瘤组织进行质量检测，将质量合格的组织进行后续的测序和评估步骤，能避免因组织样品质量差引起的变异信息漏检，从而提高免疫检查点抑制剂敏感性预测的准确性。

在一些实施方案中，在通过高通量测序数据评估基因突变时，仅评估符合以下标准的突变：

(1)对于点突变：

该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次；包含该点突变的每个读段质量值>40,包含该点突变的每个读段上与该点突变相对应的碱基质量值>21；包含有该点突变的读段的条数≥5 条；包含有该点突变的所有读段中正向的读段与反向的读段比例<1\/6；和肿瘤组织的变异等位基因频率\/对照组织的变异等位基因频率≥20;

(2)对于插入缺失(indel):

如果插入缺失中连续相同的碱基<5，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>600次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5 条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1\/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率\/对照组织的变异等位基因频率≥20;

如果插入缺失中连续相同的碱基≥5且<7，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>60 次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5 条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1\/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率\/对照组织的变异等位基因频率>20；且所述肿瘤组织的变异等位基因频率≥10%；

如果插入缺失中连续相同的碱基≥7，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>60次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5 条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1\/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率\/对照组织的变异等位基因频率>20；且所述肿瘤组织的变异等位基因频率≥20%。

本领域技术人员可以理解，上述方法步骤的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述方法步骤中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

在第三方面，本发明提供一种用于预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的装置，所述癌症是非小细胞肺癌（NSCLC），所述装置包括以下三个模块：

评估模块I)，其评估所述患者的肿瘤组织中的TP53基因突变和\/或表达；

评估模块II)，其评估所述患者的肿瘤组织中的KMT2C基因突变和\/或表达；和

预测模块III)，其基于评估模块I)、II)的评估结果预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性。

在一些实施方案中，评估模块I)、II)通过比较肿瘤组织与对照组织的测序数据，例如基因组测序数据和\/或外显子组测序数据评估所述TP53基因突变和KMT2C基因突变。

在一些实施方案中，评估模块II)确定TP53基因编码区是否存在突变，例如移码突变。在一些实施方案中，所述突变位于TP53基因的285-864位核苷酸、954-1074位核苷酸内。在一些优选实施方案中，评估模块II)确定TP53基因编码区是否存在使TP53蛋白截短的突变。

在一些实施方案中，评估模块II)确定KMT2C基因编码区是否存在突变。在一些实施方案中，所述KMT2C基因突变是导致高肿瘤突变负荷(TMB)的突变。在一些实施方案，所述突变位于KMT2C基因的3999-7788位核苷酸、9375-13071位核苷酸内。

在一些实施方案中，评估模块I)、II)仅评估符合以下标准的突变：

(1)对于点突变：

(2)对于插入缺失(indel):

在第四方面，本发明还提供一种用于预测癌症患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性的装置，所述癌症是非小细胞肺癌（NSCLC），所述装置包括：存储器，用于存储程序；处理器，用于通过执行上述存储器存储的程序以实现本发明第二方面的方法的全部或部分步骤。

在第五方面，本发明还提供一种计算机可读存储介质，其包括程序，该程序能够被处理器执行以实现本发明第二方面的方法的全部或部分步骤。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1.目前，NSCLC患者的免疫检查点抑制剂(ICI)治疗仅使用PD-L1和TMB作为适合治疗的生物标志物。然而，在通过PD-L1或TMB选择出的NSCLC患者中，客观响应率仍然只有大约20%左右，同时一些PD-L1阴性表达的 NSCLC患者也报道为对ICI有响应。在本发明中，通过组合考虑TP53和KMT2C基因突变和\/或表达状态，能够准确预测NSCLC患者中对ICI敏感的群体，避免盲目用药，提高ICI治疗的经济性能。

2.本发明中筛选出TP53和KMT2C基因共突变作为预测NSCLC患者中对ICI敏感的群体的生物标志物，相对于其他基因组合的共突变而言，预测结果更精准；且本发明中采用的TP53和KMT2C基因共突变在实际应用中可以作为独立预测风险因素，提高检测效率。

3.TP53和KMT2C两个基因的突变状态揭示患者对免疫疗法，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的敏感性，有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，且相比PD-L1免疫组化方法需要人工判读免疫组化片子以及TMB需要人为确定阈值这两点来说，基因突变状态的检测更为可靠。

附图说明

图1 KMT2C突变与野生型患者肿瘤突变负荷（TMB）的比较；

图2 KMT2C突变与野生型患者肿瘤PD-L1表达的比较；

图3 KMT2C与TP53不同突变状态的肿瘤突变负荷（TMB）的比较；

图4 KMT2C与TP53不同突变状态的PD-L1表达的比较；

图5 KMT2C突变与野生型患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图6 KMT2C与TP53不同突变状态的患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图7 KMT2C与TP53共突变组合，Cox多因素回归分析与使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法疗效相关的独立风险因素；

图8 KRAS与TP53不同突变状态的患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图9 KRAS与TP53共突变组合，Cox多因素回归分析与使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法疗效相关的独立风险因素；

图10 PTPRD与TP53不同突变状态的患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图11 PTPRD与TP53共突变组合，Cox多因素回归分析与使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法疗效相关的独立风险因素；

图12 HGF与TP53不同突变状态的患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图13 HGF与TP53共突变组合，Cox多因素回归分析与使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法疗效相关的独立风险因素。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

实施例1

基因组分析

研究了来自中国非小细胞肺癌（NSCLC）患者的FFPE肿瘤样品和配对的外周全血对照样品。所有患者均提供书面知情同意书。在OrigiMed进行靶向捕获的下一代测序(NGS)，涉及包含450个癌症相关基因的组合。通过DNA FFPE Tissue Kit和DNA Mini试剂盒(QIAamp)分别从肿瘤含量不低于20％的全部未染色FFPE切片和全血中提取DNA，然后用dsDNA HS测定试剂盒(Qubit)定量。使用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA Biosystems)将约250bp超声处理的DNA片段化构建文库，然后进行PCR扩增和定量。使用自定义组合进行杂交捕获，该组和覆盖了2.6Mb的人类基因组，靶向450个癌症相关基因和某些经常重排的内含子。将捕获后的文库混合、变性并稀释至1.5-1.8pM，随后按照制造商的方案在IlluminaNextSeq 500上进行配对末端测序。

其中样品使用以下三组引物对扩增ACTIN基因来进行质量检测：

i) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’（SEQ ID NO:1）和5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’（ SEQ ID NO:2），

ii) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’ （ SEQ ID NO:1）和5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’ （ SEQ ID NO:3），和

iii) 5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’ （ SEQ ID NO:1）和5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’ （ SEQ ID NO:4），其分别扩增100bp、200bp和300bp的片段。当三组引物均扩增到目的片段时判定组织样品质量合格。

基因组改变分析

评估了基因组改变，包括单碱基取代(SNV)、短和长插入缺失、拷贝数变异(CNV)和基因重排和融合。使用Burrows-Wheeler Aligner进行原始读段与人类基因组参考序列(hg19)的比对，然后使用Picard的MarkDuplicates算法进行PCR去重。读取深度小于30x，链偏好性(strand bias)大于10％或VAF <0.5％的变体被移除。定义为来自dbSNP数据库(版本147)的或频率超过外显子组测序项目6500 (ESP6500)的1.5％的或超过1000基因组计划的1.5％的常见单核苷酸多态性(SNP)也被排除在外。

通过以下标准判断所鉴别的突变是否为真：

(1)对于点突变：

(2)对于插入缺失(indel):

TMB计算

除了基因组改变的常规检测之外，TMB也通过基于NGS的算法确定。通过计数体细胞突变来估计TMB，所述体细胞突变包括所检查的编码区序列的每兆碱基的SNV和插入缺失。排除了dbSNP中的驱动基因突变和已知的种系改变。

实施例2

总共有637名非小细胞肺癌（NSCLC）患者参与了这项研究。病人的特征如表1所示。大多数患者为男性(355\/637，55.7%)，诊断时的中位年龄为60岁(IQR，53-67岁)。最常见的组织学类型为非鳞状细胞癌(N=553，86.8%)，包括腺癌(N=537)和其他非鳞状细胞癌(N=16)。其中Ⅰ期211例(33.1%)，Ⅱ期64例(10%)，Ⅲ期138例(21.7%)，Ⅳ期224例(35.2%)。对637例患者进行PD-L1和TMB检测。PD-L1的表达和TMB根据人口统计学特征的分布情况如表1所示。弱阳性(PD-L1 TPS评分=1-49%)和强阳性PD-L1表达(PD-L1 TPS评分≥为50%)分别为16.5%和10%。我们对PD-L1表达(作为分类变量评估，截断值为1%和50%)与非小细胞肺癌的临床特征之间的关系进行了单因素分析(表1)。TPS<1%、1-49%与≥50%之间的平均年龄无显著性差异(P>0.05)。PD-L1在男性(P=0.002)和鳞状细胞癌(P<0.001)中表达较高。整体人群的TMB中位数为4.6 muts\/Mb (IQR，2.3-10)。TMB≥10muts\/Mb的肿瘤占29.4%。我们发现年龄与TMB呈正相关 (p < 0.001)。另外，男性患者组(p < 0.001)以及鳞状细胞癌患者组(p< 0.001)的TMB值较高。

实施例3

637名NSCLC患者队列中前三位的突变基因是TP53(55.9％)、EGFR(51.3％)和KRAS(12.6％)。637名NSCLC患者中有32名患者携带KMT2C基因突变，占5%。32名KMT2C突变患者中有24名患者同时携带有TP53基因突变，占75%。KMT2C突变患者的TMB显著高于KMT2C野生型患者（中位TMB：13.1 vs. 4.6， p<0.001）（图1）。KMT2C突变患者的PD-L1阳性表达率（PD-L1TPS≥1%）高于KMT2C野生型患者（34.4% vs. 26.1%， p＞0.05）（图2）。

637名NSCLC患者队列中，42.9% （273\/637）是TP53-WT\/KMT2C-WT患者，1.3% （8\/637）是TP53-WT\/KMT2C-MUT患者，52.1%（332\/637）是TP53-MUT\/KMT2C-WT患者，3.7%（24\/637）是TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者。TP53-WT\/KMT2C-MUT患者肿瘤TMB显著高于TP53-WT\/KMT2C-WT患者（中位TMB：10.8 vs. 3.1， p=0.007）；TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者肿瘤TMB显著高于TP53-MUT\/KMT2C-WT患者（中位TMB：15.2 vs. 6.6， p=0.002）；TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者肿瘤TMB显著高于TP53-WT\/KMT2C-WT患者（中位TMB：15.2 vs. 3.1， p<0.001）（图3）。TP53-WT\/KMT2C-MUT患者肿瘤的PD-L1阳性表达率（PD-L1 TPS≥1%）高于TP53-WT\/KMT2C-WT患者（25% vs. 16.1%， p＞0.05）。TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者肿瘤的PD-L1阳性表达率（PD-L1 TPS≥1%）高于TP53-MUT\/KMT2C-WT患者（37.5% vs. 34.4%， p＞0.05）（图4）。

可见，临床实验数据表明，TP53和KMT2C基因突变和\/或表达状态，能够准确预测NSCLC患者中对ICI敏感的群体，提高ICI治疗的经济性能。

实施例4

为了进一步验证KMT2C突变对于免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗的预测价值，我们通过下载公共数据库队列信息进行外部验证。我们在cBioPortal网站（http:\/\/www.cbioportal.org\/）下载了Rizvi等人上传的队列数据，Rizvi队列纳入了240名接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的非小细胞肺癌患者，具体患者基线资料可参考文献。240个患者中，KMT2C突变患者有25名（10.4%），KMT2C突变的患者接受免疫治疗后的中位PFS较KMT2C野生型患者长（中位PFS：5.47 vs. 3.17 月，p=0.058）（图5）。进一步按照KMT2C与TP53突变状态进行分组，92名为TP53-WT\/KMT2C-WT患者，123名是TP53-MUT\/KMT2C-WT患者，7名是TP53-WT\/KMT2C-MUT患者以及18名TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者。这四组的中位PFS分别为2.47月 (95% CI 2.03–3.5), 2.57月 (95% CI 1.63–NA), 4.2月(95% CI 3.23–5.37), 7.33月 (95% CI 2.50–NA)（图6），Cox多因素分析结果进一步说明KMT2C\/TP53共突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素（TP53-MUT\/KMT2C-MUT vs TP53-WT\/KMT2C-WT, HR: 0.51, 95%CI: 0.27-0.96, p=0.036）（图7）。

可见，KMT2C\/TP53基因突变可作为免疫治疗biomarker，相比PD-L1免疫组化方法需要人工判读免疫组化片子以及TMB需要人为确定阈值这两点来说，基因突变状态的检测更为可靠。

实施例5

鉴于KRAS、TP53基因都可以用于预测NSCLC患者对PD-1的抑制剂治疗的响应，且与GMS呈现出正相关，为了进一步说明本发明的KMT2C\/TP53共突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素，本发明针对KRAS\/TP53共突变进行了类似的研究。我们在cBioPortal网站（http:\/\/www.cbioportal.org\/）下载了Rizvi等人上传的队列数据，Rizvi队列纳入了240名接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的非小细胞肺癌患者。240个患者中，进一步按照KRAS与TP53突变状态进行分组，45 名为KRAS-WT\/TP53-WT患者，109名是KRAS-WT\/TP53-MUT患者，54名是KRAS-MUT\/TP53-WT患者，以及32名KRAS-MUT\/TP53-MUT患者。这四组的中位PFS 分别为2.6 月 (95% CI 1.93–5.27), 3.6 月 (95% CI 3.07–5.37), 2.33 月 (95% CI 1.93–4.37), 5.77 月 (95%CI 4.27–NA)（图8），Cox 多因素分析结果进一步说明KRAS\/TP53共突变不是免疫治疗预后的独立预测风险因素（KRAS-MUT\/TP53-MUT vs KRAS-WT\/TP53-WT, HR: 0.58, 95%CI: 0.33-1.04, p=0.067），因为COX回归的p>0.05（图9）。

实施例6

鉴于PTPRD、TP53基因都可以用于预测NSCLC患者对PD-1的抑制剂治疗的响应，且与GMS呈现出正相关，为了进一步说明本发明的KMT2C\/TP53共突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素，本发明针对PTPRD\/TP53共突变进行了类似的研究。我们在cBioPortal网站（http:\/\/www.cbioportal.org\/）下载了Rizvi等人上传的队列数据，Rizvi队列纳入了240名接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的非小细胞肺癌患者。240个患者中，进一步按照PTPRD 与TP53 突变状态进行分组，91 名为PTPRD-WT\/TP53-WT 患者，119 名是PTPRD -WT\/TP53-MUT患者，8名是PTPRD-MUT\/TP53-WT患者以及22名PTPRD -MUT\/TP53-MUT患者。这四组的中位PFS 分别为2.47 月 (95% CI 2.03–3.5), 3.8 月 (95%CI 3.1–5.33), 2.79 月 (95% CI 2.1–NA), 6.33 月 (95%CI 4.17–NA)（图10），Cox 多因素分析结果进一步说明PTPRD\/TP53共突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素（PTPRD-MUT\/TP53-MUT vs PTPRD-WT\/TP53-WT, HR: 0.52, 95%CI: 0.30-0.92, p=0.026）（图11）。

实施例7

鉴于HGF、TP53基因都可以用于预测NSCLC患者对PD-1的抑制剂治疗的响应，且与GMS呈现出正相关，为了进一步说明本发明的KMT2C\/TP53共突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素，本发明针对HGF\/TP53共突变进行了类似的研究。我们在cBioPortal网站（http:\/\/www.cbioportal.org\/）下载了Rizvi等人上传的队列数据，Rizvi队列纳入了240名接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的非小细胞肺癌患者。240个患者中，进一步按照HGF 与TP53 突变状态进行分组，96 名为HGF-WT\/TP53-WT患者，127名是HGF-WT\/TP53-MUT患者，3名是HGF -MUT\/TP53-WT 患者以及14名HGF -MUT\/TP53-MUT患者。这四组的中位PFS 分别为2.57 月 (95% CI 2.1–3.5), 4.17 月 (95% CI 3.3–5.43),1.6 月 (95% CI 1.57–NA), 5.1 月 (95%CI 3.17–NA)（图12），Cox 多因素分析结果进一步说明HGF\/TP53 共突变不是免疫治疗预后的独立预测风险因素（HGF-MUT\/TP53-MUT\/ vsHGF-WT\/TP53-WT, HR: 0.57, 95%CI: 0.29-1.12, p=0.104）（图13），因为COX回归的p>0.05。

效果例

经过实施例4-7中分别对KMT2C\/TP53共突变、KRAS\/TP53突变、PTPRD\/TP53共突变、HGF\/TP53共突变的生存分析研究，结果显示，TP53-MUT\/KMT2C-MUT患者中位PFS分别为7.33月(95% CI 2.5–NA)，TP53-MUT\/KRAS-MUT患者中位PFS分别为5.77月(95%CI 4.27–NA)，TP53-MUT\/PTPRD-MUT患者中位PFS分别为6.33月(95%CI 4.17–NA)，TP53-MUT\/HGF-MUT患者中位PFS分别为5.1 月(95%CI 3.17–NA)，从中位生存方面可以看到TP53\/KMT2C组合的免疫治疗疗效预测效果最好。

同时，Cox比例风险模型（cox proportional-hazards model），简称Cox模型是由英国统计学家D.R.Cox(1972)年提出的一种半参数回归模型。该模型以生存结局和生存时间为应变量，可同时分析众多因素对生存期的影响，能分析带有截尾生存时间的资料，且不要求估计资料的生存分布类型，Cox模型可以同时处理多个因素对生存结局的影响，所以是临床研究中针对生存数据的最经典的多因素分析方法。而风险比（hazard ratio，简称HR）则是Cox模型中最主要的概念，在癌症研究中：hazard ratio>1被认为是 bad prognosticfactor，hazard ratio <1 被认为是 good prognostic factor，而HR越小，则代表该组预后越好（HR越小代表该组发生事件风险越小，比如HR=0.51代表相对于对照组，实验组发生事件风险下降了49%），TP53-MUT\/KMT2C-MUT 组HR: 0.51, 95%CI: 0.27-0.96, p=0.036，TP53-MUT\/KRAS -MUT组HR: 0.58, 95%CI: 0.33-1.04, p=0.067，TP53-MUT\/PTPRD -MUT组0.52, 95%CI: 0.30-0.92, p=0.026，TP53-MUT\/HGF-MUT组0.57, 95%CI: 0.29-1.12, p=0.104。从HR角度来看TP53-MUT\/KMT2C–MUT组合是最优的。

以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 至本医疗科技（上海）有限公司

<120> 一种预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法的敏感性的方法

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cacactgtgc ccatctatga gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

cacgctcggt gaggatcttc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

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设计图

一种预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法的敏感性的方法论文和设计

一种预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫疗法的敏感性的方法论文和设计-张史钺

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