食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产B类β—内酰胺酶与底物、抑制剂互作机制研究

论文摘要

金黄色葡萄球菌是广泛存在于自然界中的典型革兰氏阳性食源性致病微生物。近年来,随着抗生素在养殖业中的过度使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA,methicillin-resistant Staphylococcus aureus）已在畜产品中检出,并通过食物链传递至食物中,从而导致人体食物中毒。随着食品安全意识的不断上升以及食源性金葡菌感染的频频爆发,人们对金葡菌感染的防治日益关注。MRSA分泌耐药酶种类多,其中B类金属β-内酰胺酶（MBLs,class B metallo-b-lactamases）在MRSA介导的耐药性中发挥重要作用,可水解几乎所有β-内酰胺类抗生素,是目前抗MRSA抑菌剂研发的主要靶点。虽然目前有关MBLs文献报道较多,但其作用机制至今尚未阐明。基于此,本文采用分子动力学模拟的方法,对几种食源性耐药菌分泌MBLs催化水解底物作用机制进行分析确证,为开发新型天然耐药抑制剂,有效控制耐药菌感染提供新思路。主要研究结果如下:1.b-内酰胺酶ULA-300（β-lactamase N1）结构同源模建及NDM-1,VIM-1三维结构优化。通过同源模建方法构建ULA-300（β-lactamase N1）蛋白三级结构,该结构进行微秒级分子动力学模拟,以确定其稳定结构。随后,分别以NDM-1（PDB code:3ZR9）,VIM-1（PDB code:5N5G）晶体结构为模拟初始结构,对该结构进行1000 ns的分子动力学模拟,最终确定NDM-1,VIM-1稳定的3D结构。2.b-内酰胺酶（β-lactamase N1）水解底物头孢硝噻的作用机制。本文通过分子模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）计算,对β-lactamase N1与底物头孢硝噻的复合物体系进行了研究,预测了β-lactamase N1对头孢硝噻水解催化机理。分子动力学模拟结果表明,催化反应开始于Gln171与水分子之间氢键的形成,从而被β-lactamase N1捕获用于催化水解。此外,羧基以配位键方式与Zn2配位。结合能分解表明Phe169通过苯环间的堆积相互作用锚定了硝基苯基团。Phe169和Zn2将硝基碳烯定位在特定的方向。β-lactamase N1的活性位点为Gln171和Phe169,其对于底物的头孢硝噻水解反应是至关重要的。3.氨曲南（aztreonam）与b-内酰胺酶NDM-1及VIM-1相互作用机制分析。本文借助分子动力学模拟的手段系统研究了aztreonam与两种β-内酰胺酶NDM-1及VIM-1的具体结合方式。抑制剂与蛋白的相互作用能计算和分子动力学轨迹的统计分析结果表明,天冬氨酸（NDM-1的天冬氨酸124,VIM-1的天冬氨酸118）在蛋白与氨曲南的结合过程中起到主要作用。然而,根据结合自由能的计算,Asp118与氨曲南的结合能比Asp124与氨曲南的结合能弱。通过对模拟轨迹的分析,确证了在VIM-1与aztreonam复合物体系中,由于His201、His240侧链与氨曲南噻唑环之间的p-p相互作用,氨曲南的磺酰基部分与Asp118的结合能降低,导致VIM-1对氨曲南的水解活性损失。4.阿维巴坦（avibactam）与b-内酰胺酶NDM-1及VIM-1相互作用机制分析。分子动力学模拟研究表明,底物avibactam恰好可结合于NDM-1,VIM-1活性区域,可与NDM-1结合区域活性位点氨基酸残基Ile35,Val73,His120,His122,Asp124,His189,Cys208,Lys211,Gly219,Asn220,His250及VIM-1活性位点氨基酸残基Phe62,Tyr67,Trp87,His116,Asp117,Asp118,His179,Gly209,Asn210,His240形成较强相互作用。在NDM-1-avibactam及VIM-1-avibactam复合物体系中,avibactam可与活性区域天冬氨酸Asp124、Asp118均可形成较强的相互作用(（35）Etotal<-3 kcal/mol),从而导致NDM-1、VIM-1均可水解底物avibactam。上述结果说明,NDM-1中Asp124及VIM-1中Asp118能有效促进底物的水解。5.茶黄素抗b-内酰胺酶NDM-1及VIM-1作用机制分析。本章利用计算生物学方法对NDM-1、VIM-1结合茶黄素复合物体系进行了研究。结果表明,茶黄素可结合于NDM-1,VIM-1活性区域,可与NDM-1结合区域活性位点氨基酸残基Trp93,His122,Gln123,Asp124,Lys211,His250及VIM-1活性位点氨基酸残基Tyr67,Asp118,His179,Val200,His201,His240形成较强相互作用。分解结合自由能结果表明,在NDM-1-茶黄素及VIM-1-茶黄素复合物体系中,茶黄素可与活性区域氨基酸残基均可形成较强的相互作用,与底物形成竞争性结合,从而抑制NDM-1、VIM-1水解活性。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 食源性致病菌概述
•     1.1.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）
•     1.1.2 β-内酰胺酶MBLs
•   1.2 分子模拟理论基础和计算方法简介
•     1.2.1 分子动力学基本原理
•     1.2.2 力场简介
•     1.2.3 常用力场介绍
•   1.3 本文研究内容
• 第二章 β-内酰胺酶ULA-300（β-lactamase N1）、NDM-1、VIM-1三级结构构建及分子动力学模拟
•   2.1 引言
•   2.2 实验方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 ULA-300（β-lactamase N1）蛋白三维结构模建
•     2.3.2 NDM-1蛋白三维结构模建
•     2.3.3 VIM-1蛋白三维结构模建
•   2.4 本章小结
• 第三章 β-内酰胺酶ULA-300（β-lactamase N1）催化水解底物头孢硝噻分子机制
•   3.1 引言
•   3.2 实验方法
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 ULA-300（β-lactamase N1）蛋白与头孢硝噻分子对接
•     3.3.2 ULA-300（β-lactamase N1）蛋白与头孢硝噻复合物体系分子动力学模拟
•     3.3.3 ULA-300（β-lactamase N1）蛋白与头孢硝噻复合物体系催化水解机制
•   3.4 本章小结
• 第四章 β-内酰胺酶NDM-1及VIM-1 催化水解底物aztreonam分子机制
•   4.1 引言
•   4.2 实验方法
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 受体蛋白NDM-1,VIM-1与底物aztreonam分子对接
•     4.3.2 受体蛋白与aztreonam复合物体系分子动力学模拟
•     4.3.3 NDM-1,VIM-1 水解aztreonam机制分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 β-内酰胺酶NDM-1及VIM-1催化水解底物avibactam分子机制
•   5.1 引言
•   5.2 实验方法
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 受体蛋白NDM-1,VIM-1与底物avibactam分子对接
•     5.3.2 受体蛋白与avibactam复合物体系分子动力学模拟
•   5.4 本章小结
• 第六章 茶黄素（TFs）抗β-内酰胺酶NDM-1及VIM-1作用机制分析
•   6.1 引言
•   6.2 实验方法
•   6.3 结果与讨论
•     6.3.1 受体蛋白NDM-1,VIM-1与底物TFs分子对接
•     6.3.2 受体蛋白与TFs复合物体系分子动力学模拟
•   6.4 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介及科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 于一丁

导师: 牛效迪

关键词: 食源性金黄色葡萄球菌,内酰胺酶,分子动力学模拟,天然抑菌剂

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 吉林大学

分类号: TS201.3

总页数: 149

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