体内外微环境对大鼠脂肪来源干细胞干性维持的影响及机制研究

论文摘要

背景:脂肪来源干细胞（Adipose-derived stromal cells,ADSCs）是应用于组织工程和细胞治疗的一类重要的间充质干细胞（Mesenchymal stromal cells,MSCs）。然而,伴随体外扩增培养所致ADSCs干性维持降低是限制其应用的主要瓶颈之一,失去体内微环境则是导致该瓶颈的关键因素。相关研究提示组织微环境内的一种或多种分泌因子可有效调控ADSCs的生物学特性。其中有研究发现微环境中持续高表达的胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）可能参与调控多种干细胞的干性,但是目前尚不清楚该因子是否对ADSCs的生物学特征产生影响。进一步,为了更全面的阐述微环境对ADSCs的影响,许多研究者着力于构建不同程度模拟体内微环境的培养模型,并证实这些模型有利于在体外维持ADSCs的干性。然而这些研究并不能反映真实的组织微环境。因此如何更好的模拟体内微环境从而维持ADSCs的干性是亟待解决的关键问题。目的:探讨IGF2对大鼠ADSCs干性维持的作用及机制;构建原位组织内干细胞培养模型,明确体内微环境对ADSCs干性维持的影响及机制。方法:第一部分:分离、培养大鼠ADSCs并鉴定。第二部分:（1）qRT-PCR和Western blot检测不同年龄大鼠脂肪组织中IGF2的表达。（2）MTT和Western blot分别检测不同浓度IGF2对ADSCs增殖和干性分子NANOG,OCT4和SOX2的表达。（3）添加特异性IGF-1R/IR抑制剂BMS-754807和IGF-1R抑制剂Picropodophyllin（PPP）,检测IGF2对ADSCs增殖、干性相关分子表达、成脂和成骨分化的影响。第三部分:（1）通过向裸鼠双侧腹股沟脂肪组织内注射体外第4代大鼠GFP-ADSCs的方法构建原位干细胞培养模型。在注射后第3、5和7天收集体内培养GFP-ADSCs,并收集同时期常规体外培养的细胞。根据培养模式不同,将GFP-ADSCs分为三组:体内组、体外组和对照组（第4代ADSCs）,并进行干性相关指标的检测。（2）采用MTT、CFU-F和qRT-PCR法检测ADSCs的增殖能力;qRT-PCR、Western blot和IF法检测干性分子的表达;利用特异性染色和qRT-PCR分析ADSCs的成脂、成骨和成软骨分化能力。（3）RNA-seq技术检测三组ADSCs的mRNA表达,并对差异表达基因进行GO以及Pathway富集分析,采用qRT-PCR验证测序结果。结果:第一部分:分离培养的低代数ADSCs具有MSCs的形态特征和三向分化能力,同时高表达CD90和CD29,并很少表达CD34和CD45。第二部分:（1）大鼠脂肪组织中IGF2的表达在出生10天后呈降低趋势。（2）在1%血清条件下,加入外源性100 ng/mL IGF2可促进ADSCs增殖和干性分子的表达,该作用可被BMS-754807阻断,而PPP仅抑制其促干性分子表达的作用。（3）加入100 ng/mL IGF2可提高ADSCs成脂和成骨分化,该作用可被BMS-754807中和,而PPP仅抵消其促成脂分化作用。第三部分:（1）随着体内培养时间延长,ADSCs的数量逐渐减少。从形态学来看,体内培养的ADSCs呈现三维生长方式,具有多个伪足,在体外贴壁培养24小时后细胞呈长梭型,具有强折光度。而体外组ADSCs多数表现为宽而平的形态,其折光度降低。（2）体内培养至第3、5和7天,MTT提示ADSCs的增殖较体外组显著上调,衰老相关标记P15和P21表达降低,而CFU-F能力仅在第5和7天高于体外组。（3）体内培养ADSCs至第3天,干性相关分子的表达较体外组无差异,而第5和7天,其表达显著上调。（4）相较于体外组,体内组ADSCs在第3天,其成软骨分化能力显著上调;于第5天,成骨分化上调;于第7天,成脂分化上调。（5）RNA-seq结果提示,体内与体外组ADSCs之间有1308个差异表达基因;体外组与对照组有419个差异表达基因。GO和KEGG富集分析提示差异表达基因主要定位于细胞外基质和细胞外间隙,参与调节细胞增殖和细胞外基质合成等。这其中,干细胞多能性调控、Jak-STAT、Notch等通路可能参与维持ADSCs的干性（P<0.05）。结论:大鼠脂肪组织中IGF2的表达在出生10后天呈降低趋势,而外源性IGF2可通过IGF-1R和IR维持8周龄大鼠ADSCs的干性,提示脂肪组织微环境中IGF2可能参与调控ADSCs的干性维持过程。另一方面,原位脂肪组织内培养有利于维持ADSCs增殖及多能性,这一过程受多种基因的协同调控,其中干细胞多能性调控、Jak-STAT和Notch等通路可能参与调控。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
•   参考文献
• 第一部分 大鼠ADSCs的分离、培养、纯化与鉴定
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
•   参考文献
• 第二部分 IGF2 对大鼠ADSCs增殖和多向分化能力的作用及机制
•   1 材料与方法
•   2 结果
•   3 讨论
•   参考文献
• 第三部分 原位脂肪组织内培养对ADSCs增殖和多向分化的作用及机制
•   第一节 原位组织内培养对ADSCs增殖和多向分化能力的作用
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
•   第二节 基于转录组测序探讨体内外培养模式中ADSCs的干性维持机制
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
• 全文总结
• 文献综述：间充质干细胞干性维持的研究进展
•   参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 汪超

导师: 许峰,张波

关键词: 脂肪来源干细胞,胰岛素样生长因子,增殖,分化,干细胞治疗

来源: 重庆医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 重庆医科大学

分类号: R329.2

总页数: 132

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