用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究

论文摘要

L-赖氨酸脱羧酶（L-lysine decarboxylase EC 4.1.1.18）是生物体内催化L-赖氨酸发生脱羧反应生成戊二胺的高度专一性酶,需要磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate,PLP）作为辅因子。该酶是生物法合成戊二胺体系中的关键酶。目前,L-赖氨酸脱羧酶酶活力不高、稳定性较差等原因是生物合成体系效率低下的瓶颈问题。因此,从环境微生物中挖掘新型且具有优良特性的L-赖氨酸脱羧酶,具有重要的现实意义和工业应用价值。本研究中采用直接提取法构建了亚热带山区富含有机质土壤的宏基因组文库。基于功能筛选策略,从文库中筛选到1个新的L-赖氨酸脱羧酶基因ldc1E（GenBank登录号:KX463450）,序列分析、功能域分析以及进化关系分析结果表明Ldc1E属于III型磷酸吡哆醛依赖型脱羧酶和天冬氨酸氨基转移酶超家族。目前,国际上暂未发现利用宏基因组学技术完成新的L-赖氨酸脱羧酶基因功能研究的报道。对ldc1E基因进行克隆,实现其在大肠杆菌表达系统中过量表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤脱盐处理,得到了纯度较高的Ldc1E蛋白。产物鉴定结果表明:Ldc1E具有催化L-赖氨酸转化为戊二胺的能力;其最适作用温度为40°C,最适pH为6.5;Km值为1.08 mM,Vmax值为23.13μM/min,kcat值为5.09/s,比活力为1.53 U/mg;Ldc1E蛋白在30°C条件下保温1 h,稳定性较好,酶活性保持在80%左右,在pH 6.5-7.0条件下保存24 h,稳定性较好,酶活性保持在80%左右;5 mM的金属离子Mg2+和Ca2+对Ldc1E有微弱的激活作用;Ldc1E对化学试剂EDTA和DMSO表现出良好的耐受性;底物谱分析结果表明,Ldc1E对L-精氨酸和L-鸟氨酸均具有一定的催化作用。基于序列分析、同源建模分析以及定点突变技术,对Ldc1E与辅因子、底物分子结合的关键位点及其作用机制进行研究,结果表明,Ldc1E在空间结构和活性中心具有一定的保守性。突变体Y308A、E526D、V524A和L536A的酶活较野生型酶有很大幅度的降低,表明Y308、E526、V524和L536位点的突变对酶催化活性有显著影响。突变体K367A、K367R、S364A、H366A、E526A和W333A的酶活性完全丧失,表明K367、S364、H366、E526和W333就是Ldc1E的关键结合位点,对催化活性起着至关重要的作用。我们推测:K367、S364、H366和W333的侧链与辅因子PLP之间存在相互作用力,这4个位点的突变导致PLP与Ldc1E的结合在空间构象上发生改变,从而使Ldc1E不能与底物发生催化作用;E526、V524和L536的侧链与底物分子之间存在相互作用力,这3个位点的突变导致底物在活性位点处的空间构象不稳定,从而使Ldc1E催化底物的效率降低。利用纯培养技术,分离筛选到1株产L-赖氨酸脱羧酶活性较高的菌株L-2。形态学观察结果表明L-2菌株属于革兰氏阴性杆状细菌,大小约为2.1μm×0.75μm。通过16S rDNA基因鉴定、生理生化性质鉴定以及基因组水平上的序列比对分析,将产L-赖氨酸脱羧酶L-2菌株鉴定为Klebsiella quasipneumoniae subsp.similipneumoniae L-2。对Klebsiella quasipneumoniae subsp.similipneumoniae L-2菌株中的L-赖氨酸脱羧酶基因cad1A和ldc1C进行克隆,实现其在大肠杆菌表达系统中过量表达,通过Ni-NTA亲和层析和超滤脱盐处理后得到了纯度较高的Cad1A和Ldc1C蛋白。序列分析、结构域分析以及进化亲缘关系分析结果表明Cad1A属于诱导型酶,Ldc1C属于组成型酶,在结构上都属于α/β结构,属于III型磷酸吡哆醛依赖型脱羧酶和天冬氨酸氨基转移酶超家族。酶学特性研究表明:Cad1A和Ldc1C都具有催化L-赖氨酸转化为戊二胺的能力,且Cad1A的催化能力要高于Ldc1C;最适作用温度均为40°C,最适作用pH分别为5.5和8.0;Cad1A的Km值为0.42mM,Vmax值为36.27μM/min,kcat值为199.83/s,比活力为110.72 U/mg;Ldc1C的Km值为0.69 mM,Vmax值为17.28μM/min,kcat值为5.49/s,比活力为2.99 U/mg;Cad1A和Ldc1C在40°C条件下具有较好的热稳定性;Cad1A在偏酸性的条件下稳定性较好,Ldc1C在中性偏碱性条件下较为稳定;Cad1A不依赖金属离子,而5 mM的Mg2+和Ca2+对Ldc1C有微弱的激活作用,两者对化学试剂EDTA和DMSO表现出良好的耐受性。综上,基于宏基因组学技术和纯培养技术,以亚热带山区富含有机质土壤为研究对象,挖掘出系列新的L-赖氨酸脱羧酶基因,对其结构进行了研究,对其功能进行了测试分析。研究成果不仅丰富了L-赖氨酸脱羧酶资源库,而且为该酶的工业化应用奠定了基础,提供了新的材料。同时,Ldc1E与辅因子和底物分子结合位点及作用机制的研究对分子改造L-赖氨酸脱羧酶提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩写说明
• 第一章 前言
•   1.1 L-赖氨酸脱羧酶
•     1.1.1 L-赖氨酸脱羧酶概述
•     1.1.2 L-赖氨酸脱羧酶的来源
•     1.1.3 L-赖氨酸脱羧酶的特性
•     1.1.4 L-赖氨酸脱羧酶的结构
•     1.1.5 L-赖氨酸脱羧酶的催化机理
•     1.1.6 L-赖氨酸脱羧酶在微生物抵抗酸环境中的作用
•     1.1.7 L-赖氨酸脱羧酶的应用
•   1.2 戊二胺的概述
•     1.2.1 戊二胺的生物学功能
•     1.2.2 戊二胺的合成
•     1.2.3 戊二胺的应用
•   1.3 宏基因组学
•     1.3.1 宏基因组学概述
•     1.3.2 宏基因组文库的筛选策略
•     1.3.3 宏基因组学的应用
•   1.4 纯培养技术
•   1.5 分子模拟技术在蛋白质结构与功能研究的应用
•     1.5.1 同源建模
•     1.5.2 分子对接
•   1.6 本课题研究的目的、意义和主要内容
•     1.6.1 本课题的研究目的和意义
•     1.6.2 本课题的研究内容
• 第二章 亚热带山区土壤宏基因组文库的构建与L-赖氨酸脱羧酶筛选
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 样品来源
•     2.2.2 菌种和质粒
•     2.2.3 培养基
•     2.2.4 主要仪器设备
•     2.2.5 主要试剂和溶液配制
•     2.2.6 宏基因组DNA的提取
•     2.2.7 宏基因组文库的构建与保存
•     2.2.8 宏基因组文库质粒多样性鉴定
•     2.2.9 宏基因组文库的筛选
•     2.2.10 L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆及序列分析
•     2.2.11 菌种保存
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 宏基因组DNA的提取
•     2.3.2 宏基因组文库的构建
•     2.3.3 宏基因组文库质量鉴定
•     2.3.4 L-赖氨酸脱羧酶基因的活性筛选
•     2.3.5 L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆
•     2.3.6 L-赖氨酸脱羧酶基因的序列分析
•     2.3.7 L-赖氨酸脱羧酶ldc1E基因多重序列比对分析
•     2.3.8 L-赖氨酸脱羧酶ldc1E基因进化关系的分析
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 L-赖氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌表达系统中表达及其酶学特性研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 主要试剂和溶液配制
•     3.2.3 主要仪器设备
•     3.2.4 质粒DNA的提取
•     3.2.5 L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆和载体的构建
•     3.2.6 L-赖氨酸脱羧酶在大肠杆菌表达系统进行表达
•     3.2.7 L-赖氨酸脱羧酶酶学性质鉴定
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 L-赖氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌系统中的表达与纯化
•     3.3.2 L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E酶学性质研究
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 L-赖氨酸脱羧酶的突变体研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 L-赖氨酸脱羧酶的同源建模分析
•     4.2.2 L-赖氨酸脱羧酶的分子对接分析
•     4.2.3 L-赖氨酸脱羧酶突变体的构建
•     4.2.4 L-赖氨酸脱羧酶突变体的表达
•     4.2.5 L-赖氨酸脱羧酶突变酶酶活测定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E蛋白结构的分析
•     4.3.2 L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E突变体的构建
•     4.3.3 L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E突变体的表达
•     4.3.4 L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E突变体酶活性测定
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 产L-赖氨酸脱羧酶菌株的筛选和鉴定
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 样品来源
•     5.2.2 主要试剂
•     5.2.3 实验仪器
•     5.2.4 培养基
•     5.2.5 产酶菌株的筛选
•     5.2.6 粗酶液制备
•     5.2.7 L-赖氨酸脱羧酶活性测定方法
•     5.2.8 产酶菌株的鉴定
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 L-赖氨酸脱羧酶菌株的筛选结果
•     5.3.2 菌落形态观察
•     5.3.3 产L-赖氨酸脱羧酶菌株的生长曲线和p H变化曲线
•     5.3.4 16SrDNA基因鉴定及系统发育树构建
•     5.3.5 菌株生理生化特性鉴定
•     5.3.6 产L-赖氨酸脱羧酶菌株L-2 的全基因组测序分析
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 第六章 Klebsiella quasipneumoniae subsp.similipneumoniae L-2中L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及酶学特性研究
•   6.1 引言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 菌株和质粒
•     6.2.2 主要试剂、溶液和仪器设备
•     6.2.3 生物信息学分析
•     6.2.4 L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆和载体的构建
•     6.2.5 L-赖氨酸脱羧酶在大肠杆菌表达系统进行表达
•     6.2.6 L-赖氨酸脱羧酶的酶学性质鉴定
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 cad1A和 ldc1C基因序列分析及其编码的LDC蛋白理化性质预测分析
•     6.3.2 cad1A和 ldc1C基因在大肠杆菌系统中的表达
•     6.3.3 Cad1A的酶学特性分析
•     6.3.4 Ldc1C的酶学特性分析
•   6.4 讨论
•   6.5 小结
• 第七章 总结、展望和创新点
•   7.1 总结
•   7.2 展望
•   7.3 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间科研成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 邓洁

导师: 蒋承建

关键词: 赖氨酸脱羧酶,宏基因组学,定点突变技术,酶学特性,结构与功能,纯培养技术

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q78

DOI: 10.27034/d.cnki.ggxiu.2019.000010

总页数: 176

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