内切葡聚糖酶BcsZ在大肠杆菌中的分泌机制探究

论文摘要

内切纤维素酶在生物化学工业中发挥着无比重要的作用,例如医药、食品和生物燃料等行业。它们可以从许多种生物体中分泌到细胞外,然而,其分泌机制很少受到关注。先前的研究表明,大肠杆菌内源性内切葡聚糖酶BcsZ可以从大肠杆菌DH5α中分泌到细胞外,但是其分泌机制仍一无所知。我们的主要工作是对其分泌机制进行进一步的探究。我们证明了BcsZ在胞外的积累是一种特异性的分泌活动,而不是由大肠杆菌细胞裂解造成的。此外,BcsZ的分泌是以周质空间为中转站的两步过程。BcsZ的N末端存在一个由21个氨基酸残基组成的典型信号肽,它对于转运是必需的,但我们证明其跨内膜并不依赖Sec和TAT途径。我们推测可能存在某些未知的信号肽依赖性孔道蛋白可以介导BcsZ的跨膜转运。同时,我们对BcsZ的跨外膜转运进行了初步的探索,但未得到明确的结论。为了探究BcsZ跨内膜转运的具体机制,我们开发了一种生长偶联的筛选策略以在大肠杆菌全基因组突变文库中寻找影响其分泌的基因。通过将靶蛋白与来自枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶(SacB)融合,实现了蛋白定位与蔗糖敏感性的精确偶联。最终,我们通过这种筛选系统两个关键蛋白DnaK和CRP。作为分子伴侣,DnaK可能在BcsZ的跨膜转运过程中具有重要作用,而全局转录调控因子CRP可能在这个过程中起到某种特定的调控作用。总之,我们的研究加深了对大肠杆菌中BcsZ跨膜转运的认识,为其具体的分泌机制研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写符号说明
• 第一章 绪论
•   1.1 内切纤维素酶BcsZ
•   1.2 革兰氏阴性菌的蛋白分泌系统
•     1.2.1 Type Ⅰ分泌系统（T1SS）
•     1.2.2 Type Ⅱ分泌系统（T2SS）
•     1.2.3 Type Ⅲ分泌系统（T3SS）
•     1.2.4 Type Ⅳ分泌系统（T4SS）
•     1.2.5 Type Ⅴ分泌系统（T5SS）
•     1.2.6 Type Ⅵ分泌系统（T6SS）
•   1.3 蔗糖果聚糖酶SacB
•   1.4 革兰氏阴性菌蛋白跨内膜转运途径分析方法
• 第二章 内切葡聚糖酶BcsZ在大肠杆菌中的分泌机制探究
•   2.1 导言:本实验的意义、目的及创新点
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株
•     2.2.2 质粒和寡核苷酸序列
•     2.2.3 分子生物学实验常用酶
•     2.2.4 本论文中所使用的试剂盒
•     2.2.5 常用生化试剂与药品
•     2.2.6 培养基与相关试剂的配制
•     2.2.7 实验所用到的仪器和设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌种的保藏及活化方法
•     2.3.2 细菌基因组DNA的提取
•     2.3.3 细菌总RNA的提取
•     2.3.4 质粒DNA提取
•     2.3.5 PCR扩增反应
•     2.3.6 PCR产物纯化回收
•     2.3.7 琼脂糖凝胶产物的纯化
•     2.3.8 酶切体系和方法
•     2.3.9 T4 DNA连接酶连接反应体系
•     2.3.10 体外Gibson组装方法
•     2.3.11 大肠杆菌化学转化法
•     2.3.12 蛋白表达和纯化
•     2.3.13 周质空间蛋白提取的方法
•     2.3.14 SDS-PAGE和Western blotting分析
•     2.3.15 基因敲除
•     2.3.16 定点突变
•     2.3.17 刚果红染色
•     2.3.18 大肠杆菌膜蛋白提取
•     2.3.19 体内蛋白交联-质谱法鉴定与BcsZ互作的蛋白
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 BcsZ分泌到胞外的过程不是由细胞裂解造成的
•     2.4.2 周质空间可能作为BcsZ分泌过程的中转站
•     2.4.3 BcsZ的跨内膜转运并不依赖Sec和TAT分泌系统
•     2.4.4 BcsZ跨外膜转运途径探索
•     2.4.5 BcsZ跨膜转运需要ATP和PMF
•     2.4.6 体内交联法鉴定与BcsZ互作蛋白
•   2.5 本章小结
• 第三章 生长偶联的筛选系统筛选影响BcsZ跨内膜转运的因子
•   3.1 导言: 本实验的意义、目的及创新点
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株
•     3.2.2 质粒和引物序列
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 利用EZ-Tn5转座子插入突变构建E.coli DH5a基因组突变文库
•     3.3.2 基于SacB的筛选策略
•     3.3.3 SacB融合蛋白的酶活测定
•     3.3.4 RNA提取和qRT-PCR分析
•     3.3.5 其他实验方法
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 基于SacB的生长偶联筛选系统的建立
•     3.4.2 MBP-SacB筛选系统的验证
•     3.4.3 CRP在BcsZ跨内膜转运过程中具有某种调控作用
•     3.4.4 分子伴侣DnaK参与BcsZ的跨内膜转运过程
•   3.5 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄昊

导师: 祁庆生

关键词: 大肠杆菌,蛋白跨膜转运,内切葡聚糖酶,生长偶联筛选系统,果聚糖蔗糖酶

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

分类号: Q936

总页数: 63

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