小白链霉菌响应低pH胁迫生理机制的初步解析

论文摘要

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是一种新型生物食品防腐剂,主要由小白链霉菌好氧发酵所得,其合成受环境低pH值的严格调控。因此,研究小白链霉菌在低pH环境中的生理响应机制,对于揭示ε-PL生物合成机制和强化其ε-PL生物合成能力具有重要的理论和应用价值。本文以Streptomyces albulus M-Z18为研究对象,以不同pH（pH 4.0、5.0和5.5）的恒化培养(D=0.04 h-1)为研究体系,借助微生物生理学、转录组学和分子生物学等研究手段,初步探明了S.albulus M-Z18响应低pH胁迫的生理反应,并鉴定了常见耐酸系统在S.albulus M-Z18抵御低pH环境中的作用。取得的主要研究结果如下:（1）在微环境水平探究了低pH胁迫对S.albulus M-Z18的影响。基于以葡萄糖为限制性碳源建立的恒化培养体系,胞内pH值（pHi）分析发现,环境pH值为4.0-5.5时,pHi均在7.5左右,表明S.albulus M-Z18在低pH胁迫中存在稳定pHi的机制。H+-ATPase活力和胞内ATP浓度分析发现,pH 4.0时H+-ATPase活力和胞内ATP浓度分别为pH 5.5时的3.02和2.67倍。进一步分析发现,低pH胁迫还导致细胞膜脂肪酸不饱和度和平均碳链长度的增加,以及胞内L-赖氨酸和L-精氨酸等碱性氨基酸的积累。上述研究结果表明,S.albulus M-Z18是通过H+-ATPase活力的提高和胞内碱性氨基酸的积累实现pHi稳定;同时,通过改变细胞膜流动性加快胞内外物质和能量的交换以维持低pH胁迫中的基本代谢功能。（2）在基因转录层面分析了低pH胁迫对S.albulus M-Z18的影响。基于比较转录组学分析发现,低pH胁迫强化了糖酵解第二阶段、TCA循环和氧化磷酸化,同时削弱了戊糖磷酸途径非氧化阶段,最终导致葡萄糖优先用于代谢产能;氨基酸的合成整体被削弱,但L-赖氨酸和L-精氨酸的合成被加强;脂肪酸的合成也被整体削弱,但是参与长链脂肪酸降解相关基因的显著下调以及脂肪酸去饱和酶编码基因的显著上调,故引起细胞膜脂肪酸不饱和度和平均碳链长度的增加。另外,分子伴侣（如DnaK、DnaJ和GroES）和ATP依赖性蛋白酶（Clp蛋白酶）编码基因的显著上调,增强了蛋白质修复与降解的能力;核苷酸切除修复和非同源末端连接修复相关编码基因的显著上调,增强了修复严重损伤DNA的能力;精氨酸脱亚胺酶系统（ADI）、谷氨酸脱羧酶系统（GAD）和尿素酶系统相关基因的显著上调,增强了维持pHi稳定的能力。上述分析,一方面印证了S.albulus M-Z18微环境水平做出的生理响应,另一方面揭示了潜在的耐酸系统。（3）基于基因失活和过表达突变株的构建以及外源添加实验,研究了ADI、GAD、赖氨酸脱羧酶系统（CAD）、ε-PL合成和尿素酶系统对S.albulus M-Z18抵御低pH胁迫的作用。arcA（编码精氨酸脱亚胺酶）和gadB（编码谷氨酸脱羧酶）的插入失活导致低pH胁迫中生物量的降低,比对照分别减少了8.3%和6.4%,而过表达两个基因会导致生物量的微弱升高,表明ADI和GAD系统可能参与pHi稳定,但贡献有限。cadA（编码赖氨酸脱羧酶）的敲除和pls（编码ε-聚赖氨酸合成酶）的插入失活几乎不影响低pH胁迫中的生长。S.albulus M-Z18存在尿素酶系统并能分解尿素使环境pH迅速上升。上述研究结果表明,常见氨基酸依赖性耐酸系统不是S.albulus M-Z18主要的耐酸途径,而尿素酶系统可能是一条重要的耐酸途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 ε-聚赖氨酸
•     1.1.1 ε-聚赖氨酸的简介
•     1.1.2 ε-聚赖氨酸的合成机制
•   1.2 小白链霉菌合成ε-聚赖氨酸与环境pH的关系
•     1.2.1 小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的p H调控策略
•     1.2.2 小白链霉菌在酸性p H中积累ε-聚赖氨酸的初步机制
•   1.3 微生物响应酸胁迫的机制
• +-ATPase'>    1.3.1 H⁺-ATPase
•     1.3.2 氨基酸依赖性脱羧酶/反向转运系统
•     1.3.3 脱氨酶和脱亚胺酶系统
•     1.3.4 尿素酶系统
•     1.3.5 大分子保护与修复机制
•     1.3.6 细胞膜组分的改变
•   1.4 本论文研究目的、意义和内容
•     1.4.1 研究目的和研究意义
•     1.4.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株、质粒和引物
•     2.1.2 培养基和溶液
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 主要试剂
•   2.2 小白链霉菌M-Z18 细胞生理水平响应低pH胁迫
•     2.2.1 菌株培养
•     2.2.2 S.albulus M-Z18 致死与亚致死pH值的确定
•     2.2.3 ε-PL浓度的测定
•     2.2.4 菌体干重（DCW）的测定
•     2.2.5 葡萄糖浓度的测定
•     2.2.6 动力学参数的计算
•     2.2.7 胞内pH值的测定
• +-ATPase酶活的测定'>    2.2.8 H⁺-ATPase酶活的测定
•     2.2.9 胞内ATP浓度的测定
•     2.2.10 细胞膜脂肪酸组分的测定
•     2.2.11 胞内氨基酸的测定
•     2.2.12 蛋白浓度的测定
•   2.3 小白链霉菌M-Z18 基因转录水平响应低pH胁迫
•     2.3.1 RNA-Seq样品制备
•     2.3.2 建库测序流程
•     2.3.3 信息分析流程
•   2.4 小白链霉菌M-Z18 耐酸系统初探
•     2.4.1 微生物的培养
•     2.4.2 大肠杆菌感受态的制备与转化
•     2.4.3 大肠杆菌质粒DNA的提取
•     2.4.4 链霉菌基因组DNA的提取
•     2.4.5 插入失活（或基因敲除）和过表达载体的构建
•     2.4.6 接合转移
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 小白链霉菌M-Z18 细胞生理水平响应低pH胁迫
•     3.1.1 S.albulus M-Z18 致死与亚致死p H值探究
•     3.1.2 S.albulus M-Z18 恒化培养动力学分析
•     3.1.3 不同酸性p H对 S.albulus M-Z18 生理参数的影响
•     3.1.4 小结
•   3.2 小白链霉菌M-Z18 基因转录水平响应低pH胁迫
•     3.2.1 参考基因组比对结果
•     3.2.2 显著差异表达基因分析
•     3.2.3 糖代谢
•     3.2.4 氧化磷酸化
•     3.2.5 氨基酸的合成
•     3.2.6 脂肪酸的合成
•     3.2.7 大分子的保护与修复
•     3.2.8 耐酸机制
•     3.2.9 小结
•   3.3 小白链霉菌M-Z18 耐酸系统的初步验证
•     3.3.1 精氨酸脱亚胺酶系统（ADI）和谷氨酸脱羧酶系统（GAD）
•     3.3.2 ε-聚赖氨酸合成
•     3.3.3 赖氨酸脱羧酶系统（CAD）
•     3.3.4 尿素酶系统
•     3.3.5 小结
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王开方

导师: 陈旭升

关键词: 聚赖氨酸,小白链霉菌,转录组,低胁迫

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS202.3;TQ920.6;Q935

总页数: 70

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