2’,5’-寡腺苷酸合成酶2（OAS2）在寨卡病毒复制中的影响及其机制研究

论文摘要

研究背景:寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种新型蚊媒传播病毒,可以通过蚊虫叮咬,性传播和输血传播,对输血安全有潜在威胁。由于ZIKV的致病机制尚不完全清楚,目前尚无特异性的抗病毒药物和疫苗。因此,深入研究ZIKV感染对宿主基因表达的影响,以及这些基因在病毒复制调节中的作用,具有重要的意义。我们采用RNAseq对ZIKV感染前后的细胞中,宿主基因表达进行了检测,结果显示,ZIKV感染后干扰素刺激基因OAS2表达水平显著升高。有研究表明,OAS家族基因对丙型肝炎病毒（HCV）及登革病毒（DENV）等黄病毒复制具有显著的抑制作用。但是,OAS2对ZIKV的复制是否具有抑制作用及其调控的机制,目前尚不清楚。研究目的:1.阐明ZIKV感染对OAS2表达的影响及其机制研究;2.阐明OAS2对ZIKV复制的影响及其机制研究。研究内容:1.ZIKV感染对OAS2表达的影响;2.ZIKV感染诱导OAS2高表达的机制研究;3.OAS2对ZIKV复制的影响;4.OAS2通过激活Ⅰ型干扰素信号通路抑制ZIKV复制的机制研究。研究方:1.ZIKV感染A549,Huh7.0,Huh7.5.1,U5A和2fTGH细胞,检测病毒感染前后OAS2表达;通过比较Huh7.0与Huh7.5.1细胞感染ZIKV后OAS2表达的变化,探究ZIKV诱导OAS2高表达是否通过RIG-Ⅰ介导的通路;通过对比U5A和2fTGH细胞感染ZIKV后OAS2表达的改变,探究ZIKV诱导OAS2高表达是否通过Ⅰ型干扰素介导的通路;2.ZIKV感染A549细胞,高表达OAS2,检测OAS2对ZIKV复制以及对IFNβ抗病毒活性的影响;3.ZIKV感染A549细胞,高表达OAS2,检测OAS2对Ⅰ型干扰素及其上游RIG-Ⅰ通路的影响;4.ZIKV感染A549细胞,高表达OAS2,通过Western Blot检测信号转导和转录因子（STAT1）磷酸化;通过双荧光报告实验检测干扰素刺激反应原件（ISRE）的活性;通过qRT-PCR检测ISGs的表达情况;5.ZIKV感染A549,U5A,2fTGH以及敲低RIG-Ⅰ的A549细胞,高表达OAS2,检测OAS2对ZIKV复制的影响是否依赖于Ⅰ型干扰素信号通路。研究结果:1.ZIKV感染A549细胞,细胞内OAS2的表达水平显著升高;将A549细胞中RIG-Ⅰ敲低后,ZIKV诱导的OAS2显著降低;高表达RIG-Ⅰ的A549细胞中,ZIKV诱导的OAS2显著增加;2.在RIG-Ⅰ受体缺陷的Huh7.5.1细胞中,OAS2的表达降低;将RIG-Ⅰ高表达后,OAS2的表达升高。ZIKV感染2fTGH和U5A细胞,OAS2在两种细胞中均能表达,但是,OAS2在2fTGH细胞中的表达水平显著高于U5A细胞;3.感染ZIKV的A549和2fTGH细胞中,OAS2高表达显著抑制ZIKV复制,并且增强IFNβ的抗病毒活性。但是在干扰素受体缺陷的U5A细胞中,OAS2高表达对ZIKV复制无影响;4.OAS2高表达激活RIG-Ⅰ通路促进IFNβ的产生;5.OAS2高表达激活了 Jak/STAT信号通路,促进STAT1水平的磷酸化,增强ISRE的活性,诱导其它ISGs的表达;6.敲低A549细胞中的RIG-Ⅰ,高表达OAS2对ZIKV复制无影响。研究结论:OAS2在ZIKV复制中起着重要的调节作用。ZIKV感染后通过RIG-Ⅰ依赖的通路诱导OAS2高表达,且这种诱导作用不完全依赖于Ⅰ型干扰素信号通路;OAS2高表达通过促进IFNβ产生以及激活Ⅰ型干扰素信号通路抑制ZIKV复制且增强IFNβ的抗病毒活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 研究背景
• 研究目的和意义
• 研究技术路线
• 第一部分 ZIKV感染对OAS2表达的影响及其机制研究
•   研究材料
•   研究方法
•     1 细胞培养
•     2 质粒转染
•     3 ZIKV感染实验
•     4 细胞内总RNA提取
•     5 逆转录PCR
•     6 荧光定量PCR
•     7 数据分析
•   实验结果
•     1 ZIKV感染调节宿主抗病毒基因的表达
•     2 ZIKV感染A549细胞诱导OAS2高表达
•     3 ZIKV通过调节Ⅰ型干扰素信号通路诱导OAS2高表达
•       3.1 ZIKV诱导OAS2高表达通过RIG-I依赖的通路
•       3.2 ZIKV诱导OAS2高表达不完全依赖于Ⅰ型干扰素
•   结论
•   讨论
• 第二部分 OAS2对ZIKV复制的影响及其机制研究
•   研究材料
•   研究方法
•     1 β-干扰素刺激实验
•     2 OAS2基因的克隆和重组质粒的构建
•     3 CCK8试剂检测细胞活性
•     4 双荧光报告基因
•     5 细胞总蛋白质提取
•     6 BCA检测细胞浓度
•     7 Western Blot
•   实验结果
•     1 p3flag-cmv-7.1-OAS2构建以及表达验证
•       1.1 β-干扰素诱导OAS2高表达
•       1.2 OAS2基因片段成功构建到载体p3flag-cmv-7.1
•       1.3 测序正确的p3flag-cmv-7.1-OAS2质粒酶切鉴定
•       1.4 p3flag-cmv-7.1-OAS2质粒在A549细胞中高表达
•     2 OAS2高表达抑制ZIKV复制,且增强IFNβ的抗病毒活性
•     3 高表达OAS2促进IFNβ生成
•     4 高表达OAS2激活Ⅰ型干扰素信号通路
•       4.1 高表达OAS2促进STAT1磷酸化
•       4.2 高表达OAS2增强ISRE活性
•       4.3 高表达OAS2促进其它ISGs的表达
•     5 OAS2抑制ZIKV复制依赖于干扰素介导的Jak/STAT信号通路
•     6 OAS2抑制ZIKV复制依赖于RIG-Ⅰ
•   结论
•   讨论
• 参考文献
• 文献综述
•   References
• 英文缩略词
• 个人简介
• 賴

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 廖鑫忠

导师: 陈利民

关键词: 寨卡病毒,干扰素,型干扰素信号通路

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000487

总页数: 79

文件大小: 5187K

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