CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究

CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究

论文摘要

5-甲基胞嘧啶(m5C)作为RNA的一种普遍的修饰近年来得到广泛的关注。越来越多的研究表明,RNAm5C修饰在RNA加工、RNA稳定性、RNA出核转运以及mRNA翻译等过程中起到重要作用。NSUN2(NOP2/Sun domain family,member 2)是哺乳动物RNAm5C甲基转移酶之一,主要负责tRNA和mRNA的甲基化。最近研究表明,NSUN2参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、干细胞分化、脑和睾丸发育以及肿瘤发生等。但对NSUN2在生物体发育和疾病发生中的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。本研究以肾小管上皮细胞系HEK293和肝癌细胞系HepG2为研究模型,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NSUN2基因,观察NSUN2敲除后细胞的表型、基因表达和mRNA m5C修饰的变化,进而阐明NSUN2基因及其RNA m5C修饰的生物学功能和作用。1.利用CRISPR/Cas9技术建立RNA m5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将抗性筛选标记(NeoR和PuroR)及转录终止信号BGH poly(A)整合至NSUN2基因第一外显子上终止NSUN2基因的转录。针对NSUN2基因,设计并筛选出具有高基因编辑效率的gRNA位点。构建出用于沉默NSUN2表达并筛选NSUN2去表达细胞系的Donor载体,NSUN2-PURO-BGH-Donor和NSUN2-NEO-BGH-Donor。通过转染、药物筛选和鉴定等过程,我们最后得到NSUN2基因沉默效率稳定维持在99%和90%的HEK293细胞系及HepG2细胞系,为研究NSUN2基因的功能奠定基础。2.NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞表型影响分析本研究旨在了解NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系生理表型的影响。我们通过绘制细胞生长曲线、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、小管形成实验和流式细胞术等方法检测了 NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞增殖、迁移和转移等能力的影响。结果表明,NSUN2基因敲除能显著抑制HEK293细胞和HepG2细胞的增殖和迁移能力,这一抑制作用能通过重新表达NSUN2来恢复。NSUN2基因参与细胞周期进程调控,基因敲除能影响HepG2细胞周期分布,导致G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多。NSUN2基因还介导肿瘤细胞的转移,NSUN2基因敲除能显著抑制HepG2细胞侵袭能力。此外,我们发现NSUN2基因参与调节肿瘤细胞的血管新生过程,NSUN2基因敲除显著抑制HepG2细胞血管新生能力。3.转录组测序检测NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系基因表达的影响本研究旨在了解NSUN2基因敲除对细胞基因表达谱的影响。我们通过高通量测序研究NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞mRNA的表达谱的影响。结果显示,NSUN2基因敲除后,在HEK293和HepG2细胞中分别筛选到967和2681个差异表达基因。功能分析表明,HEK293细胞差异表达基因通过神经配体-受体互作、蛋白消化和吸收、系统性红斑狼疮、ECM受体互作等信号通路影响细胞黏附、神经系统发育、细胞表面受体信号、细胞分化和细胞增殖等生物过程。HepG2细胞的差异表达基因则与细胞信号转导、迁移、增殖、血管新生、细胞黏附、炎症反应及神经系统发生等生物过程显著相关。其主要富集到Hippo信号通路、癌症通路、神经配体-受体互作、ECM-受体互作、Wnt通路以及MAPK信号通路等。进一步分析表明,ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt信号途径可能参与到NSUN2基因敲除介导的细胞增殖和迁移抑制,其中TGFB1、THBS1、CD44、TGFA和LOXL2等基因可能发挥重要作用。我们结果在分子水平上表明NSUN2基因参与调节的生物进程和影响的信号通路。4.RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除对HEK293和HepG2细胞m5C修饰影响为了解NSUN2基因介导RNA甲基化的功能,我们通过RNA-BisSeq技术检测分析NSUN2基因敲除对基因RNA甲基化影响。结果显示,在HEK293和HepG2细胞中共检测到4052和2192个差异甲基化位点,分布于1185和707个mRNA中。通过BSP法,我们对测序结果进行验证,并证实了结果的可靠性。对差异甲基化基因功能分析发现,在HEK293细胞中,差异RNA甲基化基因功能主要涉及翻译、mRNA加工、mRNA剪接、mRNA出核转运和mRNA稳定性等,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。在HepG2细胞中,差异甲基化基因主要参与翻译调节、mRNA代谢、细胞黏附、蛋白折叠、RNA剪接和细胞周期等生物过程。调节通路则主要涉及核糖体、内质网蛋白质加工、剪接体、非酒精性脂肪肝、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接、PI3K-Akt信号通路和细胞周期等信号途径。综上所述,本研究建立了两个NSUN2基因敲除的细胞系。NSUN2基因敲除能显著抑制细胞增殖和迁移,影响细胞周期,抑制肿瘤细胞血管新生。NSUN2基因敲除导致的差异表达基因功能主要涉及神经系统发育、细胞信号转导、细胞分化、增殖、迁移和血管新生等生物过程,影响神经配体-受体互作、ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt等信号途径。NSUN2基因敲除导致的差异RNA甲基化基因则主要涉及转录调节、翻译起始、RNA加工和RNA稳定性等生物过程,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 文献综述
  •   1 RNA修饰研究进展
  •     1.1 假尿苷修饰
  •     1.2 肌苷(Ⅰ)修饰
  •     1.3 N7-甲基鸟嘌呤(m7G)修饰
  •     1.4 2'-O-甲基(Nm)修饰
  •     1.5 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰
  •     1.6 N1-甲基腺嘌呤(m1A)修饰
  •     1.7 5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)修饰
  •     1.8 5-甲基胞嘧啶(m5C)修饰
  •   2 RNA m5C研究进展
  •     2.1 RNA m5C的分布
  •     2.2 RNA m5C的检测方法
  •     2.3 RNA m5C甲基转移酶
  •   3 NOP2/Sun RNA甲基转移酶NSUN2研究进展
  •     3.1 NSUN2的表达与调控
  •     3.2 NSUN2介导的RNA甲基化功能
  •   4 CRISPR/Cas9基因编辑系统
  •     4.1 CRISPR/Cas系统
  •     4.2 CRISPR/Cas系统的分类
  •     4.3 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用
  •   5 本研究的目的意义和主要内容
  •     5.1 本研究的目的意义
  •     5.2 本研究的主要内容
  • 第二章 利用CRISPR/Cas9技术建立RNAm5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系
  •   1 前言
  •   2 材料
  •     2.1 细胞系及质粒载体
  •     2.2 主要试剂
  •     2.3 主要仪器
  •   3 方法
  •     3.1 NSUN2基因gRNA靶点的设计及sgRNA载体构建与筛选
  •     3.2 Donor载体的构建
  •     3.3 HEK293和HepG2细胞药筛浓度测定
  •     3.4 细胞转染
  •     3.5 单克隆细胞株筛选
  •     3.6 荧光定量PCR检测NSUN2 mRNA表达
  •     3.7 筛选细胞株基因型鉴定
  •   4 结果与分析
  •     4.1 成功构建针对人NSUN2基因的sgRNA
  •     4.2 同源重组Donor载体鉴定
  •     4.3 确定HEK293和HepG2细胞抗生素筛选浓度
  •     4.4 成功构建NSUN2基因去表达的HEK293细胞系
  •     4.5 成功构建NSUN2基因去表达的HepG2细胞系
  •   5 讨论
  •   6 小结
  • 第三章 NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞表型影响分析
  •   1 前言
  •   2 材料
  •     2.1 细胞系与载体
  •     2.2 试剂及耗材
  •     2.3 实验器材
  •   3 方法
  •     3.1 NSUN2基因过表达载体构建
  •     3.2 细胞转染
  •     3.3 NSUN2基因过表达效率的验证
  •     3.4 MTT法细胞活力检测
  •     3.5 克隆形成试验
  •     3.6 伤口愈合试验
  •     3.7 流式细胞术检测细胞周期
  •     3.8 Matrigel细胞侵袭试验
  •     3.9 小管形成试验
  •   4 结果与分析
  •     4.1 NSUN2基因敲除抑制HEK293细胞的增殖
  •     4.2 NSUN2基因敲除抑制HEK293细胞的迁移
  •     4.3 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞增殖
  •     4.4 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的迁移
  •     4.5 NSUN2基因敲除影响HepG2细胞周期
  •     4.6 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的侵袭能力
  •     4.7 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的血管新生能力
  •   5 讨论
  •   6 小结
  • 第四章 转录组测序检测NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系基因表达的影响
  •   1 前言
  •   2 材料
  •     2.1 细胞系
  •     2.2 主要试剂
  •     2.3 主要仪器
  •   3 方法
  •     3.1 转录组测序
  •     3.2 数据分析
  •     3.3 转录组测序结果的验证
  •   4 结果与分析
  •     4.1 RNA样品质量控制
  •     4.2 测序数据与基因组比对结果
  •     4.3 基因表达水平分布
  •     4.4 RNA-Seq相关性
  •     4.5 差异表达基因筛选
  •     4.6 差异表达基因聚类分析
  •     4.7 HEK293细胞差异表达基因GO富集分析
  •     4.8 HEK293细胞差异表达基因KEGG通路富集分析
  •     4.9 HepG2细胞差异表达基因功能富集分析
  •     4.10 HepG2细胞差异表达基因KEGG通路富集分析
  •     4.11 RNA-Seq结果验证
  •   5 讨论
  •   6 小结
  • 第五章 RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除对RNA m5C修饰的影响
  •   1 前言
  •   2 材料
  •     2.1 细胞
  •     2.2 试剂
  •     2.3 仪器
  •   3 方法
  •     3.1 细胞总RNA的提取
  •     3.2 去除rRNA
  •     3.3 重亚硫酸盐转化RNA
  •     3.4 RNA亚硫酸盐转化效率检测
  •     3.5 cDNA文库构建
  •     3.6 cDNA文库质控
  •     3.7 测序
  •     3.8 数据分析
  •     3.9 RNA BisSeq测序结果验证
  •   4 结果与分析
  •     4.1 RNA质检结果
  •     4.2 RNA样本亚硫酸盐转化效果验证
  •     4.3 文库质检结果
  •     4.4 差异甲基化位点分析
  •     4.5 HEK293细胞差异甲基化基因功能分析
  •     4.6 HepG2细胞差异甲基化基因功能分析
  •     4.7 BSP(Bisulfite sequencing PCR)法验证 RNA-BisSeq结果
  •   5 讨论
  •   6 小结
  • 全文总结、创新点和研究展望
  •   1 全文总结
  •   2 创新点
  •   3 研究展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 博士期间研究成果
  • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 孙振

    导师: 崔恒宓

    关键词: 甲基化,基因敲除

    来源: 扬州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 扬州大学

    基金: 国家科学自然基金项目(81773013),国家重点研发计划(2016YFC1303604),国家自然科学基金重大研究计划(91540117)

    分类号: Q78

    DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000058

    总页数: 147

    文件大小: 11990K

    下载量: 200

    相关论文文献

    • [1].长链非编码RNA、焦亡和心肌缺血-再灌注损伤[J]. 生物化学与生物物理进展 2019(12)
    • [2].非小细胞肺癌的潜在生物标记物:长链非编码RNA[J]. 现代肿瘤医学 2020(01)
    • [3].非编码RNA在细胞自噬中的研究进展[J]. 中国生物工程杂志 2019(12)
    • [4].环状RNA影响肝疾病的发生发展[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2019(12)
    • [5].环状RNA在肝细胞癌中的作用及机制[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2019(12)
    • [6].环状RNA在胃癌中的研究进展[J]. 生物技术通讯 2019(06)
    • [7].西花蓟马不同RNA干扰技术比较研究[J]. 福建农业学报 2019(10)
    • [8].微小RNA在非酒精性脂肪肝病中调控作用的研究进展[J]. 重庆医科大学学报 2019(12)
    • [9].卵巢上皮性癌中RNA结合基序蛋白3及环氧化酶-2的表达与意义[J]. 医疗装备 2019(23)
    • [10].非编码RNA在周围神经损伤修复中的重要角色和作用[J]. 中国组织工程研究 2020(14)
    • [11].长链非编码RNA在鼻咽癌中的研究进展[J]. 中国医药 2020(01)
    • [12].微小循环RNA在鉴别前列腺增生和前列腺癌的有效性分析[J]. 临床泌尿外科杂志 2020(01)
    • [13].长链非编码RNA调控肝纤维化信号通路的研究进展[J]. 胃肠病学 2019(11)
    • [14].环状RNA在肺腺癌中的差异表达分析[J]. 东南大学学报(医学版) 2019(06)
    • [15].环状RNA调控结肠直肠癌的研究进展[J]. 外科理论与实践 2019(06)
    • [16].RNA干扰药物——下一代治疗药物?[J]. 科学通报 2020(07)
    • [17].环状RNA生物学功能及其在组织修复过程中的作用[J]. 中国组织工程研究 2020(17)
    • [18].Deep Learning Deciphers Protein–RNA Interaction[J]. Genomics,Proteomics & Bioinformatics 2019(05)
    • [19].CIRCexplorer3:A CLEAR Pipeline for Direct Comparison of Circular and Linear RNA Expression[J]. Genomics,Proteomics & Bioinformatics 2019(05)
    • [20].环状RNA在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的研究进展[J]. 心血管病学进展 2019(09)
    • [21].心肌纤维化研究的新领域——长链非编码RNA[J]. 心血管病学进展 2019(09)
    • [22].长链非编码RNA及相关调控通路与急性心肌梗死的研究进展[J]. 心血管病学进展 2019(08)
    • [23].微小RNA在自身免疫性甲状腺疾病中的研究进展[J]. 江苏大学学报(医学版) 2020(01)
    • [24].结直肠癌相关长链非编码RNA调控信号通路研究进展[J]. 西部医学 2020(02)
    • [25].环状RNA与肝癌相互关系的研究进展[J]. 中国卫生检验杂志 2020(03)
    • [26].非编码RNA在葡萄膜炎发生发展过程中的调控作用研究进展[J]. 眼科新进展 2020(01)
    • [27].长链非编码RNA在心血管疾病中的研究进展[J]. 临床误诊误治 2020(02)
    • [28].长链非编码RNA影响糖尿病心肌病的研究[J]. 糖尿病新世界 2020(01)
    • [29].骨肉瘤中环状RNA的研究进展[J]. 临床与病理杂志 2020(02)
    • [30].长链非编码RNA作为肾细胞癌预后生物标志物的研究新进展[J]. 现代肿瘤医学 2020(05)

    标签:;  ;  

    CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢