MARVELD1参与小鼠干细胞分化和体细胞重编程的作用及机制研究

论文摘要

上皮间质转化（EMT）和间质上皮转化（MET）与发育和癌症中细胞“干性”密切相关。EMT在干细胞体外诱导分化过程中具有关键作用;相对的,在成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的过渡阶段发生MET,MET过程对诱导性多能干细胞的诱导效率有重要影响。课题组前期一系列研究表明,MARVELD1在细胞命运决定的M和E两相转变中发挥重要作用,为此本研究以EMT/MET为切入点,对MARVELD1在小鼠干细胞（ESCs）分化和体细胞重编程过程中的影响和机制进行了研究。在MARVELD1对体细胞重编程过程的影响研究中,通过实时定量PCR检测R1/E、Eph4-Ev、NIH/3T3和MEF细胞中MARVELD1的表达,发现MARVELD1在胚胎干细胞R1/E和上皮细胞Eph4-Ev中低表达,在成纤维细胞NIH/3T3和MEF细胞中高表达,MARVELD1表达与上皮/间质样和细胞干性相关。通过MTT实验检测MARVELD1下调对细胞增殖的影响,发现下调MARVELD1抑制MEF细胞的增殖;通过划痕实验检测MARVELD1对成纤维细胞迁移运动能力的影响,发现MARVELD1抑制MEF细胞的迁移运动。通过细胞表型对比和AP染色等技术,检测MARVELD1-/-MEF细胞和MARVELD1+/+MEF细胞在OKSM诱导重编程早期MET表型和诱导效率的差异发现,MARVELD1抑制体细胞重编程。MARVELD1对单因子导致MEF细胞表型和分子改变的影响研究显示,MARVELD1对Klf4感染的MEF细胞早期MET影响最大。在MARVELD1对小鼠胚胎干细胞分化的影响研究中,采用实时定量PCR检测体外诱导ESCs随机分化过程中MARVELD1的表达水平,发现MARVELD1在该过程中表达上调。对ESCs进行免疫荧光染色发现,MARVELD1下调导致上皮标志分子表达下调,对细胞全能性标志分子的表达无显著影响。分子检测发现,MARVELD1对ESCs细胞中上皮转化和细胞全能性无显著影响。构建ESCs细胞向中内胚层分化的体外诱导模型,并构建MARVELD1过表达的ESCs细胞株,对拟胚体形态学研究显示,MARVELD1上调未对ESCs胚层分化产生显著影响,分子检测也证实了该结论;对分化过程中EMT标志分子研究发现,MARVELD1抑制ESCs向中内胚层分化中的上皮间质转化过程。在对MARVELD1对重编程影响机制的研究中,采用逆转录病毒包装感染技术,构建MARVELD1过表达及其对照的MARVELD1+/+和MARVELD1-/-MEF细胞稳转细胞,采用Western Blot技术,检测上述四细胞株中组蛋白H3修饰水平,发现MARVELD1抑制MEF细胞中组蛋白H3K4me3及H3K27me3修饰。组分分离实验结果显示,MARVELD1在细胞质和细胞核内均有分布,在细胞核内与染色质结合。Co-IP技术检测结果显示,MARVELD1与组蛋白H3无直接相互作用。采用ChIP-seq实验和生物信息学数据显示,敲除MARVELD1促进H3K4me3和H3K27me3与DNA的结合,对Klf4结合位点H3K27me3修饰影响最为显著,MARVELD1抑制E-cadherin、SNAIL等MET相关基因上H3K4me3和H3K27me3修饰平衡。综上所述,本篇论文以EMT/MET为切入点,对MARVELD1在小鼠干细胞分化和体细胞重编程过程中的影响和机制进行了研究,对MARVELD1影响体细胞重编程中组蛋白修饰相关机制进行深入研究,完善对该基因功能的认识的同时,进一步深入认识干细胞分化及体细胞重编程与上皮间质转化的内在关系,为深入研究M和E两相转变在细胞命运决定中的生物学意义提供新的线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 课题来源
•   1.2 课题背景及研究的目的和意义
•   1.3 国内外在该方向的研究现状分析
•     1.3.1 MARVELD1结构与功能
•     1.3.2 体细胞重编程
•     1.3.3 ESCs细胞与分化
•   1.4 本论文研究内容与研究路线
•     1.4.1 研究内容
•     1.4.2 技术路线
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞模型
•     2.1.2 引物及shRNA序列
•     2.1.3 抗体
•     2.1.4 质粒与菌株
•     2.1.5 试剂及配置
•     2.1.6 主要实验仪器
•     2.1.7 分析软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 ESCs细胞培养
•     2.2.3 ESCs体外诱导分化
•     2.2.4 构建MARVELD1过表达载体
•     2.2.5 病毒包装及感染
•     2.2.6 MARVELD1下调细胞系的建立
•     2.2.7 诱导多能干细胞
•     2.2.8 RNA提取及逆转录
•     2.2.9 实时定量PCR
•     2.2.10 Western Blot实验
•     2.2.11 细胞增殖实验
•     2.2.12 细胞划痕实验
•     2.2.13 碱性磷酸酶染色
•     2.2.14 组分分离实验
•     2.2.15 常染色质分离及免疫共沉淀
•     2.2.16 ChIP-seq实验
•     2.2.17 免疫荧光染色
•   2.3 统计学处理
• 第3章 MARVELD1对体细胞重编程过程的影响
•   3.1 引言
•   3.2 MARVELD1在mESCs和MEF细胞中的表达情况
•   3.3 MARVELD1对成纤维细胞增殖能力的影响
•   3.4 MARVELD1对成纤维细胞迁移运动能力的影响
•   3.5 MARVELD1对MEF细胞重编程早期细胞表型的影响
•   3.6 MARVELD1对OKSM单因子导致MEF细胞表型改变的影响
•   3.7 MARVELD1对重编程早期MET标志分子表达的影响
•   3.8 本章讨论
•   3.9 本章小结
• 第4章 MARVELD1对ESCs分化过程的影响
•   4.1 引言
•   4.2 MARVELD1在ESCs分化过程中的表达变化
•   4.3 MARVELD1对mESCs细胞中EMT和全能性的影响
•   4.4 MARVELD1过表达mESCs细胞株构建
•   4.5 MARVELD1对mESCs分化细胞表型的影响
•   4.6 mESCs分化体外诱导模型的构建
•   4.7 MARVELD1对三胚层标志分子表达的影响
•   4.8 MARVELD1对mESCs分化中EMT的影响
•   4.9 本章讨论
•   4.10 本章小结
• 第5章 MARVELD1调控重编程的H3机制研究
•   5.1 引言
•   5.2 MARVELD1对MEF细胞中组蛋白H3修饰的影响
•   5.3 MARVELD1与组蛋白H3的相互作用
•   5.4 MARVELD1对H3K4me3和H3K27me3与DNA结合的影响
•   5.5 本章讨论
•   5.6 本章小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文及其他成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 乔春宵

导师: 李钰

关键词: 干细胞分化,体细胞重编程,组蛋白

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 哈尔滨工业大学

基金: 国家自然科学基金面上项目“MARVELD1调节组蛋白H4K20me1影响小鼠内胚层细胞迁移及上皮细胞分化的分子机制”,项目编号为31571323,国家自然科学基金青年项目“MARVELD1调控干细胞分化与体细胞重编程EMT,MET的机制研究”,项目编号为31701076

分类号: R329.2

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003197

总页数: 70

文件大小: 2656K

下载量: 31