一、The correlation between serum epidermal growth factor/testicular epidermal growth factor receptor and spermatogenesis in rat（论文文献综述）
李小丰[1]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究说明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
张仙玉[2]（2020）在《内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究》文中指出猪肉是我国居民肉类消费的主要来源。在现代养猪生产中,顶级种公猪通过人工授精技术可繁殖大量后代,对于提高养殖效益和经济效益发挥着重大作用。如何能大量复制顶级种公猪或其遗传物质?体细胞克隆是当前的主要技术手段,但由于克隆动物的效率低,限制了这一技术的规模化应用。将外源精原干细胞（SSCs）移植到自身无SSCs生精能力的受体睾丸中产生精子,这是一个类似于动物克隆技术,实现外源遗传物质完全复制的新途径。本文的目的是,研究制备自身SSCs消融但能利用外源SSCs生产精子的受体模型动物,为下一步建立替代克隆技术复制供体动物遗传物质的新体系打下坚实基础。全文主要研究内容包括:采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的ETV5基因,制备小鼠模型,将体外培养的正常SSCs移植到小鼠模型睾丸中,观察精子的发生,评估该技术的可行性,进一步制备ETV5基因敲除猪动物模型。全文主要结果如下:1、ETV5基因敲除小鼠的制备:（1）通过CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠ETV5基因后,纯合敲除的公鼠(ETV5-/-),从3周龄开始,其睾丸明显比野生型（WT）要小,睾丸重也显着低于WT（P<0.01）。（2）ETV5-/-小鼠睾丸生殖细胞渐行性丢失,到12周龄生殖细胞丢失殆尽,出现唯支持细胞综合症。（3）性成熟后ETV5-/-小鼠睾酮含量显着低于WT（P<0.01）,附睾中精子在12周龄丢失殆尽,且丧失了繁殖后代的能力。（4）ETV5基因杂合敲除的小鼠,其睾丸形态和发育均与WT小鼠无差别,生育能力正常。2、小鼠SSCs体外培养体系的建立:（1）通过两步酶消化法能得到活力99%以上的睾丸单细胞悬液,通过差速贴壁法获得纯度79%以上的SSCs。（2）丝裂霉素C处理之后的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,Stem Pro-34（含SFM）作为基础培养基,添加GDNF、LIF、b FGF、IGF1生长因子的复合培养体系,能支持SSCs的体外增殖与长期培养。（3）小鼠SSCs能正常冻存与复苏,在体外培养与富集后用AKP免疫染色和PLZF免疫荧光均可观察到大量阳性克隆集落。用RT-PCR和Q-PCR检测SSCs中标志基因的表达水平,均显示SSCs可在体外稳定培养增殖并维持干性。3、小鼠SSCs移植:（1）幼鼠(3周龄的ETV5-/-小鼠)作为移植受体比成鼠(7周龄的ETV5-/-小鼠)易于重启外源精子的发生。移植后2个月,幼鼠睾丸中全部恢复了精子的发生,精子统计数约为9.58±5.05×104,而成鼠受体睾丸中无精子发生的恢复。（2）荧光显微镜下,幼鼠受体附睾中产生的精子头部发出绿光,说明精子来源于外源供体的SSCs（移植前用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因）。精液中外源基因EGFP和ETV5的表达,进一步说明恢复的精子来源于外源供体的SSCs,而非内源产生。4、ETV5基因敲除猪动物模型探讨:（1）用构建成功的p X330-g RNA质粒转染莱芜猪胎儿成纤维细胞,敲除效率约为41.92%。（2）通过体细胞核移植得到8头新生克隆猪,基因型检测显示ETV5基因在靶位点被敲除,Western blot结果证实了ETV5蛋白的丢失。（3）睾丸组织切片的H.E.染色和UCHL-1蛋白的表达显示,1月龄的ETV5-/-公猪曲细精管的形态和生殖细胞与WT公猪几乎无差异。但2.5月龄的ETV5-/-公猪曲细精管管腔中央的生殖细胞有消融的趋势。另外,UCHL-1蛋白标记的阳性SSCs细胞比WT睾丸中要少。这些结果说明ETV5基因的敲除影响猪生殖细胞的发育。综上所述,本研究制备了ETV5基因纯合敲除后生殖细胞消融且无生育能力的受体小鼠;随后进行外源正常的精原干细胞移植,受体小鼠的生精能力得以恢复;最后将小鼠上构建的方法体系借鉴应用于猪受体模型的制备。目的为家畜优质个体遗传物质大量复制,物种的保种和精原干细胞研究等提供科学依据。
王琪[3]（2020）在《双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究》文中研究说明双峰驼（Camelus Bactrianus）是生存于荒漠和半荒漠草原地带的古老物种,是我国重要的优势畜种资源,具有重要的经济和科研价值。由于双峰驼是严格的季节性发情动物,其生长速度慢、生殖周期长、繁殖性能低,而且双峰驼排卵机理尚不清楚,故而本研究以双峰驼为研究对象,展开蛋白质组及差异蛋白功能的研究。首先,我们选取繁殖季节和非繁殖季节双峰驼（公驼）血清,通过蛋白质组学（i TRAQ）筛选出与生殖相关的差异蛋白,利用生物信息学及分子生物学进一步筛选和鉴定与激素合成分泌相关的差异蛋白-视黄醇结合蛋白（Retinol-Binding Protein 4,RBP4）,并通过体外细胞模型验证RBP4蛋白的功能;其次,通过i TRAQ技术筛选肌肉注射精清（Seminal Plasm,SP）诱导排卵后的卵巢组织差异表达蛋白质;利用内分泌学、组织形态学、影像学及分子生物学进一步筛选出可能参与调控诱导排卵的靶蛋白-钙离子/钙调依赖性蛋白激酶II-γ（Calcium/calmodulin kinase II-γ,CAMK2G）;最后,通过体外卵巢颗粒细胞模型研究CAMK2G对雌激素受体（ER）的调控机制。本研究所取得的结果如下。1.通过i TRAQ方法,共筛选出359个公驼的血清蛋白,基于1.2和0.8的倍数变化临界值,且p<0.05,共筛选出32种差异蛋白（11种上调和21种下调）;筛选和鉴定了5个与生殖相关的差异蛋白（PCGF5、H1.2、ANTXR2、FOLR1和RBP4）。2.RBP4在性腺轴中均有不同程度的表达,但在睾丸组织中RBP4表达水平较高;双峰驼支持细胞中添加不同浓度的Vit A,可以影响IGFs、RBP4和AR的表达水平,且对RBP4（负相关）和AR（正相关）有剂量依赖性;过表达（敲低）RBP4对IGFs的表达有抑制（促进）作用,并且同时下调（上调）AR的表达水平;RBP4可通过类固醇合成通路调控雄激素受体AR的表达。3.通过i TRAQ共筛选出404个卵巢差异表达蛋白,260个上调蛋白（SP组）,144个下调蛋白,进一步筛选出5个可能参与诱导排卵的差异蛋白（CAMK2G、FST、NR5A1、PAK1和PRL）;通过RT-PCR、Western blot和组织免疫荧光等发现,排卵前后差异蛋白在性腺轴及生殖器官中表达水平不同,推测诱导排卵过程均有性腺轴的参与。4.调控CAMK2G的表达水平对各受体及相关蛋白有不同影响;过表达/敲低CAMK2G可以上调/下调ER的表达水平;CAMK2G的特异性抑制剂KN-93可下调ER的表达水平;CAMK2G可通过介导17βHSD和P450scc的表达来调节类雌激素受体（ER）的表达水平。本研究揭示:RBP4与公驼的繁殖相关,主要参与调节雄激素的合成,故而推测RBP4可作为一个调控因子调控激素的合成分泌;CAMK2G通过参与类固醇通路调控雌激素受体的表达,推测CAMK2G可能是双峰驼诱导排卵过程的一个调控分子。
李贺[4]（2020）在《乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制》文中指出少肌症是由增龄而引起的骨骼肌蛋白代谢失衡,造成肌肉功能障碍,行动能力下降。药物、抗阻力运动以及营养干预是预防和治疗少肌症的有效方式。乳脂肪球膜蛋白具有预防和治疗少肌症的作用,但其成分复杂,作用机制尚不明确。本文从乳脂肪球膜蛋白中分离纯化出一种能够促进C2C12细胞增殖和分化的高丰度蛋白—乳脂肪球表皮生长因子-8（MFG-E8）,系统地研究了MFG-E8的结构、性质、生物学特性,MFG-E8促C2C12细胞增殖、分化、骨骼肌再生的作用机制,并通过大鼠体内实验进一步并阐明了MFG-E8促进老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的作用机制。采用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱技术,从乳脂肪球膜蛋白中筛选、分离及纯化出一种具有促进C2C12细胞增殖活性的蛋白组分—MFG-E8,其纯度为98.33%。采用LC-MS/MS、傅里叶红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）及生物信息学方法,对MFG-E8的结构和性质进行了分析;MFG-E8由431个氨基酸组成,分子量为47.82 k Da,二级结构以β结构为主（～70%以上）,α-螺旋（～5%）和无规则卷曲（～25%）所占比例较低,其三级结构为不规则球状蛋白;MFG-E8是一种具有疏水腔的亲水性球蛋白,分子内有两个跨膜区域、3个磷酸化位点及2个N-端糖基化位点;根据蛋白质-蛋白质之间相互作用和KEGG Pathway分析,MFG-E8能够参与调节血管生成、凋亡细胞清除、细胞粘附、蛋白质代谢等生物学过程,这些过程主要与ILK/Akt、αvβ6-ERK以及αvβ6/PKC等信号通路有关。MFG-E8促进C2C12细胞增殖作用与其浓度和作用时间具有显着相关性,200μg/m L MFG-E8对C2C12细胞作用48 h,细胞增殖率最大（35.8%）;MFG-E8能够降低G0/G1期和S期细胞数量,增加G2/M期细胞数量,促进C2C12细胞增殖;MFG-E8使C2C12细胞内线粒体数量增加,为细胞增殖提供能量;MFG-E8上调Myo D、Myo G以及My HC的表达,促进C2C12细胞融合成多核肌管。基于对C2C12细胞差异蛋白组分析,MFG-E8可使细胞内8种蛋白质（60S核糖体蛋白L29、NADH脱氢酶、胰岛素降解酶、Hsp40同型蛋白、组蛋白H3、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5、细胞周期蛋白以及丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A）高表达,这些蛋白质能够介导磷酸脂酰基醇3激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、氧化磷酸化以及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）四种信号通路调控细胞增殖和凋亡过程。q RT-PCR和western blot试验从分子水平证明了MFG-E8促进细胞增殖主要通过介导PI3K和ERK信号通路。MFG-E8能够激活PI3K信号通路,上调Akt的磷酸化表达量,使C2C12细胞内线粒体数量增加,进而修复损伤C2C12细胞。基于western blot和q RT-PCR试验证明了MFG-E8能够激活PI3K/Akt信号通路,促进雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的ser2448位点磷酸化,上调下游P70S6K磷酸化表达量,最终促进C2C12细胞增殖。此外,活化的Akt能够上调成肌分化因子（Myo D）、肌细胞生成素（Myo G）以及肌球蛋白重链（My HC）的表达,使C2C12细胞分化融合形成多核肌管。MFG-E8和乳清浓缩蛋白（WPC）能够降低老年少肌症模型大鼠血清中丙二醛（MDA）、脂褐素、甘油三酯（TG）、非酯化脂肪酸（NEFA）和酮体含量降低,超氧化物歧化酶（SOD）活性和胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量提高;腓肠肌纤维横截面积增加、细胞核数量增多、细胞间水肿和腊样变性现象消失,对大鼠腓肠肌具有修复和再生作用。基于q RT-PCR和western blot试验,从分子水平证明了MFG-E8和WPC均能够激活PI3K/Akt信号通路,调节腓肠肌蛋白质代谢过程;MFG-E8通过PI3K/Akt/m TOR/P70S6K信号通路,促进腓肠肌蛋白合成代谢;WPC通过PI3K/Akt/m TOR/4E-BP信号通路,抑制腓肠肌蛋白分解代谢;WPC和MFG-E8协同作用能够增强MFG-E8抑制腓肠肌蛋白分解代谢过程。
雷佳[5]（2019）在《EGFR信号诱导HMGA2转录调控的作用及其在肝癌转移中的机制研究》文中研究说明研究背景和目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种死亡率高的原发性肝癌,在全球范围内高发,尤其是亚洲,非洲和南部欧洲,在我国,肝细胞癌的发病人数几乎占到全球发病人数的一半。肝细胞癌发病隐匿,早期症状不明显,等出现症状时多已到中晚期,或伴远处转移。此时手术治疗效果不理想,导致患者很快死亡。因此,阐明肝癌的转移机制,对肝癌的早期发现及治疗有十分重要的意义。本文对肝细胞癌的转移机制进行研究,旨在发现介导肝细胞癌转移的关键分子,为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。HMGA2（high mobility group AT-hook2）是高迁移率蛋白（high mobility group,HMG）家族成员之一,此外,HMGA1（high mobility group AT-hook1）也是该家族的一员。HMGA1是一种结构性转录因子,通过与其他转录因子结合,协同调控下游靶基因的转录。研究发现,HMGA1在多种肿瘤组织（肝癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌等）中表达水平显着上调,并且可以通过调节多种靶基因的转录,促进肿瘤的增殖和转移。HMGA2蛋白主要定位于细胞核中,虽然没有转录活性,但它可以通过改变染色质的结构来调控下游基因的转录。近年来的研究表明,HMGA2蛋白在口腔癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和食管癌等多种肿瘤组织中异常增高,且与这些肿瘤的转移以及不良预后相关,但是,HMGA2在肝癌中的表达情况及其在肝癌进展中的作用研究较少。因此本课题在研读文献的基础上,研究HMGA2在肝癌转移和增殖中的作用,并探讨其相关分子机制,探索其作为肝癌治疗新靶点的潜力。第一部分:HMGA2促进肝癌转移目的通过动物模型和细胞功能研究分析HMGA2在肝癌发生发展中的作用。方法1)采用DEN构建大鼠肝癌模型,RT-PCR和Western Blot实验检测大鼠肝脏中HMGA2 mRNA和蛋白的表达。2)将HMGA2过表达质粒及其对照质粒转染至HMGA2低表达的HepG2细胞,将HMGA2shRNA及其对照质粒转染至HMGA2高表达的MHCC-97H细胞,采用MTT实验检测肝癌细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测肝癌细胞的迁移能力,Transwell铺Matrigel胶实验检测肝癌细胞的侵袭能力。3)构建裸鼠皮下移植瘤和肺转移模型,并分析HMGA2介导的基因工程细胞在肝癌增殖和转移中的作用。结果1)通过免疫组化实验发现,我们成功构建了大鼠肝癌模型;同时通过RT-PCR和Western Blot检测发现,DEN诱导组大鼠肝脏组织中HMGA2 mRNA和蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）。2)MTT,细胞划痕及Transwell实验结果表明,HepG2细胞过表达HMGA2基因后,增强了 HepG2细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）;MHCC-97H细胞敲降HMGA2基因后,MHCC-97H细胞的迁移和侵袭能力显着降低（P<0.05）。3)裸鼠皮下移植瘤的实验结果发现,过表达或敲降HMGA2基因后,对裸鼠皮下移植瘤的增殖没有显着影响。经尾静脉注射实验发现接种HepG2-HMGA2细胞的裸鼠肺部出现的结节数明显较对照组多（P<0.05）,而接种MHCC-97H-shHMGA2细胞的小鼠肺部结节数明显少于对照组（P<0.01）。结论通过肝癌动物模型及细胞功能实验显示:HMGA2能够促进肝癌细胞的转移,但对肝癌细胞的增殖没有影响。第二部分:EGFR的激活促进肝癌中HMGA2的表达目的EGFR是否为激活肝癌中HMGA2表达的上游调控基因方法1)采用ELISA法检测对照组和DEN诱导肝癌模型组大鼠血液中EGF的水平;Western Blot技术检测大鼠肝癌模型的肝脏组织中EGFR的表达及p-EGFR的水平。2)采用RT-PCR和Western Blot技术检测外源添加EGF及EGFR抑制剂后肝癌细胞中HMGA2的表达。3)采用RT-PCR和Western Blot技术检测在JAK抑制剂、ERK抑制剂和PI3K抑制剂作用下肝癌细胞中HMGA2的表达。4)通过Transwell小室实验检测在外源EGF及ERK通路抑制剂的作用下,HepG2和MHCC-97H细胞的迁移与侵袭能力。结果1)与溶剂组、空白对照组大鼠相比,肝癌模型组大鼠血浆中EGF的含量明显上调（P<0.01）;大鼠模型肝脏组织中EGFR的表达也明显上调（P<0.01）;p1068-EGFR的表达也明显较溶剂组和空白对照组多（P<0.01）。2)外源EGF孵育可以显着提高HepG2细胞和MHCC-97H细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达;而EGFR酪氨酸蛋白酶抑制剂Gefitinib可显着抑制EGF诱导的HMGA2 mRNA和蛋白表达的上调（P<0.01）。3)通过添加3种抑制剂（JAK抑制剂AG490、ERK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002）对EGFR调控HMGA2的研究发现,在肝癌细胞HepG2和MHCC-97H中,仅有ERK抑制剂PD98059能够明显抑制EGF诱导的HMGA2 mRNA和蛋白表达的上调（P<0.01）。4)Transwell小室实验发现与仅添加EGF相比,添加外源ERK通路抑制剂PD98059后,EGF诱导的HepG2和MHCC-97H细胞的迁移与侵袭能力均显着下降（P<0.01）。结论EGFR可以通过MEK-ERK通路调控肝癌细胞中HMGA2的表达。第三部分:MEK/ERK通过磷酸化ELK1调控肝癌中HMGA2的表达目的研究ERK/ELK-1是否参与了 EGFR诱导的HMGA2的表达。方法1)Western Blot技术检测EGFR对ELK1丝氨酸383位点磷酸化的影响。2)RT-PCR技术和Western Blot技术研究ELK1敲降及其Ser 383位点突变对HMGA2的转录调控作用。3)双荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀实验分析肝癌细胞系中ELK1对HMGA2的启动子区的结合。结果1)Western Blot实验发现EGF孵育后,HepG2和MHCC-97H细胞中ELK1磷酸化蛋白水平明显上调,但ELK1总蛋白量没有显着变化,其中ELK1的核移位增加;EGFR酪氨酸蛋白酶抑制剂Gefitinib和MEK/ERK通路抑制剂PD98059可以明显抑制EGFR诱导的ELK1丝氨酸383位点的磷酸化;同时大鼠肝癌模型中肝脏组织ERK1/2总蛋白,磷酸化蛋白及ELK1磷酸化蛋白的水平与细胞实验完全一致,提示EGF是通过与EGFR结合,激活MEK/ERK信号通路来诱导ELK1的磷酸化。2)ELK1基因敲减后,EGF孵育HepG2和MHCC-97H细胞,HMGA2的mRNA以及蛋白的表达明显下调;对ELK1的Ser 383位点进行突变并转染到HepG2和MHCC-97H细胞,HMGA2的mRNA和蛋白的表达明显高于空载体pcDNA3.1 组、ELK1 WT 组、ELK1 S383A 组,证明 ELK1 的 Ser 383 位点的磷酸化参与了 HMGA2的表达调控。3)双荧光素酶结果表明 p-1958-HMGA2-Luc、p-1247-HMGA2-Luc、p-867-HMGA2-Luc组与转染p-GL3 basic组质粒相比均具有较高的荧光素酶活性,而p-132-HMGA2-Luc组的荧光素酶活性与上述三组相比则明显减弱;进一步通过免疫共沉淀发现HepG2和MHCC-97H细胞在EGF孵育后HMGA2启动子区域ELK1的水平显着上调,以上结果证明HMGA2启动子区域上游217-221位点是可能是ELK1的结合位点。结论EGFR通过诱导ELK1丝氨酸383位点磷酸化并参与调控HMGA2的转录与表达。
侯晶玫[6]（2016）在《人精原干细胞系的建立及其增殖基因调控的研究》文中指出研究背景及目的:由于环境、遗传、生活方式等因素的影响,男性生育能力明显下降,男性不育已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大影响人类健康的疾病。精子发生是研究男性不育发病机制的基础,因此精原干细胞作为精子发生的起始细胞,承担着自我更新以维持干细胞池稳态和分化生成各级生殖细胞的功能,对再生医学和生殖医学领域有着重要的研究意义。然而,目前,人们对人精原干细胞的研究十分有限,主要由于人精原干细胞取材困难,数量有限以及体外长期培养体系的缺乏。因此,急需建立一个永生化的人精原干细胞系来获得足够数量的人精原干细胞用于基础研究和临床应用。此外,精原干细胞自我更新和分化的分子调控机制的相关研究大多局限于单基因或单信号通路,近年研究发现,微阵列技术能够大规模发现不同组织和细胞的基因表达特征和基因功能,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。因此,本研究的研究目的有:1)构建具有无限增殖能力的人类精原干细胞系;2)揭示人类精原干细胞增殖的基因调控机制。方法:首先,我们过表达SV40大T抗原基因构建永生化的人精原干细胞系。应用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western blots）、免疫细胞化学（Immunocytochemistry）等方法,检测该细胞系是否表达人精原细胞与人精原干细胞的基因与蛋白。随后,我们运用细胞增殖实验（CCK-8）并检测PCNA的表达,分析人精原干细胞系的增殖能力。并且,我们通过干细胞移植实验对该细胞系进行了功能验证。此外,我们还通过细胞的核型分析、Y染色体微缺失、裸鼠成瘤实验等方法,评估了人精原干细胞系的安全性。最后,我们通过GDNF、EGF、b FGF促进人精原干细胞系的增殖,应用微阵列技术（Microarray technology）、定量PCR和生物信息学技术对影响人精原干细胞增殖的大量基因及其信号通路进行了筛选和分析。结果:我们过表达SV40大T抗原基因所构建的细胞系能够表达人精原细胞及人精原干细胞的特异性标志物,包括:VASA、DAZL、MAGEA4、GFRA1、RET、UCHL1、GPR125、PLZF和THY1,表明该细胞系在生化表型上具有人类精原干细胞的基因与蛋白。免疫细胞化学显示,该细胞系表达PCNA;CCK-8细胞增殖实验表明,该细胞系能够在体外长期扩增长达1.5年以上,并具有较强的增殖能力。细胞移植实验进一步发现,人精原干细胞系在受体小鼠睾丸内表达UCHL1、PCNA、MAGEA4,表明其在体内具有增殖和克隆能力。尽管我们所构建的人精原干细胞系存在一些异常的染色体核型,但是,该细胞系没有Y染色体基因的微缺失,并且,它不产生肿瘤,表明该细胞系有较好的安全性。微阵列分析结果显示,GDNF、EGF、b FGF介导下的人精原干细胞系共有1172个基因发生了改变。随后,我们应用KEGG通路分析对这些差异表达的基因所富集的通路进行了分析。最后,我们筛选到了ID1作为候选基因,结果表明,ID1可能是参与人精原干细胞增殖的关键基因,但其调控的具体机制需进一步研究。结论:我们首次成功地构建了人精原干细胞系,此细胞系具有无限增殖能力并且有较好的安全性,为人精原干细胞的机制研究和转化医学提供了无限的细胞来源。后续的机制研究发现,多种基因和信号通路可能参与人精原干细胞的自我更新和增殖,ID1可能是人精原干细胞自我更新和增殖过程中的关键基因。
刘靖[7]（2017）在《小鼠雌性生殖干细胞的分离及其生物学特征研究》文中进行了进一步梳理哺乳动物雌性生殖研究领域传统观念认为,哺乳动物如小鼠和人类在出生时或者出生数天内卵巢中卵细胞的数目便确定了,卵巢中卵细胞无更新能力,不断出现的卵泡发生过程最终导致卵细胞的耗尽。本研究通过多次贴壁法从出生后雌性卵巢中分离出雌性生殖干细胞,在体外培养中成功发现生殖细胞旺盛分裂现象。证明了在ICR小鼠品系中,出生后小鼠卵巢中仍然存在着能旺盛分裂的雌性生殖干细胞。通过对培养体系中有丝分裂的统计分析,发现不同鼠龄卵巢具有的雌性生殖干细胞数目并不一致,而是随着小鼠卵巢发育逐步减少。在出生后1-3天的新生小鼠卵巢中,能进行有丝分离的雌性生殖细胞数目最多。通过观察雌性生殖细胞分裂现象,发现进行有丝分裂的雌性生殖干细胞直径大小为15-25 μm,在增殖过程中出现细胞连接现象,即分裂后的细胞核分离而细胞质仍然连接。这一现象与PGC向卵原细胞分化时形成的生殖细胞囊类似。在雌性生殖干细胞培养过程中,发现GDNF的去除有助于雌性生殖细胞的生长,当雌二醇（E2）和GDNF同时存在时,生殖细胞生长进一步受到抑制。为了研究GDNF与E2对雌性生殖细胞分化的协同促进作用,对Gfra1启动子进行了分析。通过荧光素酶报告系统,证明E2与雌激素受体蛋白ESR1正调控Gfra1基因的表达。通过相关实验认为,E2激活生殖干细胞中Gfra1基因的表达,通过GDNF-GFRA1-RET通路促进雌性生殖细胞的分化。磁珠分离法得到VASA+雌性生殖干细胞在细胞形态和表达谱与贴壁法分离的雌性生殖干细胞存在着差异。磁珠分选雌性生殖干细表达Sox2和Nanog,在培养过程中容易出现向多能性细胞转化现象。根据相关实验数据,认为磁珠分选的雌性生殖干细胞更接近原始生殖细胞状态,而贴壁法得到的雌性生殖干细胞更接近卵原细胞。本研究提出了新的雌性生殖干细胞分离方法,并对新方法得到的雌性生殖干细胞与磁珠分离法得到的雌性生殖干细胞生物学特征进行了比较。本研究丰富了对小鼠雌性生殖干细胞来源、增殖和分化的认识。
凡志国[8]（2011）在《小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究》文中认为精原干细胞的高效分离纯化与体外培养为精原干细胞的移植、多潜能性分化、体外诱导分化和转基因动物研究等多项研究奠定良好的基础,在医学、生物学和生物技术研究领域有着极其可贵的潜在价值。本研究以7d雄性昆系小鼠为试验材料,对小鼠精原干细胞进行分离、纯化、鉴定、培养和冷冻研究,以期获得纯度较高的分离纯化方法以及高效的培养方法和冻融技术,从而为男性不孕症的治疗和濒危物种的保护等提供一定的依据。本研究主要获得以下结果:1.小鼠精原干细胞大多以4细胞链、8细胞链和16细胞链的典型状态存在,从形态学上可以进行初步确定;碱性磷酸酶（AKP）存在小鼠精原干细胞的表面,用NBT/ BCIP试剂盒染色后,倒置显微镜下观察时可以看到棕褐色或蓝紫色的细胞,即为小鼠精原干细胞;对Beta-actin和Ngn3两个基因进行RT-PCR及凝胶电泳试验,由于Ngn3基因在支持细胞中无表达,凝胶电泳试验时没有条带,据此差异可以确定小鼠精原干细胞。本研究初步建立了小鼠精原干细胞形态学、碱性磷酸酶（AKP）染色和Ngn3基因鉴定的综合鉴定方法。2.表皮促生长因子（EGF）、胰岛素样促生长因子-1（IGF-1）和碱性成纤维细胞促生长因子（bFGF）在单独使用、两两配伍和三因子共同配伍的条件下,采用预先处理和后处理的方法培养小鼠精原干细胞时,10% FSH （30 ng/ml）预先处理组单因子EGF（10ng/ml）能够明显促进小鼠精原干细胞增殖,其增殖率分别为41.60%;用10% FSH （30 ng/ml）预后处理双因子IGF-1（20 ng/ml）和bFGF（20 ng/ml）组以及用10% FSH（30 ng/ml）的预后处理三因子EGF（20 ng/ml）、IGF-1（20 ng/ml）和bFGF （10ng/ml）组均能促进小鼠精原干细胞的大量增殖,其增殖率分别63.00%和56.60%。3.低密度脂蛋白、海藻糖和卵磷脂三种冷冻保护剂在单独使用和两两配伍条件时,3mg/ml低密度脂蛋白单独使用、3mg/ml低密度脂蛋白和0.5mg/ml的卵磷脂配伍条件时小鼠精原干细胞的冷冻复苏率显着高于其它组（p <0.05）,分别达到87.16%和90.23%,低密度脂蛋白和卵磷脂配伍有利于精原干细胞的冷冻保存。另外,-80℃超低温冰箱冷冻效果整体上要高于液氮冷冻。4.低密度脂蛋白、卵磷脂、海藻糖作为冷冻保护剂用于小鼠支持细胞的冷冻保存,分别于第1d、7d和15d检测复苏率。其中第7d时的效果最好,低密度脂蛋白、卵磷脂和海藻糖三组中的支持细胞复苏率分别为70.65%、72.86%和68.25%,显着高于其他组（p <0.05）。
孔艳[9]（2010）在《PCNA、EGFR在2型糖尿病雄性SD大鼠睾丸组织的表达及相关因素分析》文中研究表明目的：近年来,由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动的生活方式等诸多因素的影响,全球糖尿病发病率增长迅速,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。生殖系统功能障碍是糖尿病并发症之一,其发病率是非糖尿病病人的5-10倍,给患者的身心健康带来了严重的压力和困扰,近年来越来越受到重视。本研究主要通过建立2型糖尿病模型大鼠探讨两种影响生殖功能的因子,PCNA及EGFR在正常及不同病程糖尿病SD大鼠睾丸功能的影响,并观察睾丸形态,为T2DM雄性生殖功能障碍的发病机制和治疗提供一定的理论依据。方法：健康雄性SD大鼠30只,每日均自由饮水、进食饲料,随机分为3组：正常组（N组,10只）,每日予生理盐水灌胃作对照；T2DM 4周组（A组,10只）和T2DM 8周组（B组,10只）,每日予脂肪乳（高糖高脂饮食）灌胃。第7周末测定血清胰岛素,并进行比较；次日清晨称取动物体重。实验组空腹予小剂量链脲佐菌素（STZ,Sigma公司）按30mg/kg体重尾静脉注射诱导2型糖尿病模型；而正常对照组大鼠予等量无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液尾静脉注射。以FPG≥16.7mmol/L为诊断糖尿病大鼠的标准,实验组大鼠于第8周造模成功,成模后A组、B组继续维持高糖高脂饮食, A组于T2DM 4周后处死,B组于T2DM 8周后即实验结束时处死；N组与A组同期处死。断尾取血,并用罗氏血糖仪测定血糖值；腹主动脉取血离心后血清待测胰岛素、糖化血清蛋白、睾酮、血脂等。放免法检测血清胰岛素；比色法检测糖化血清蛋白；化学发光法测定血清睾酮；取双侧睾丸待免疫组化SABC法检测睾丸组织EGFR、PCNA表达,并行相关因素分析。数据采用SPSS11.5统计软件处理。结果：A,B组大鼠空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数高于N组大鼠,且差别有统计学意义（P<0.05,P<0.05）；糖化血清蛋白随病程升高,三组间都有统计学意义差异（P<0.05, P<0.05, P<0.05）; B组大鼠的胰岛素水平较N组及A组大鼠有统计学意义升高（分别为P=0.001, P=0.036）; A, B组大鼠的体重与N组大鼠相比,有统计学意义降低（P<0.05）；A、B组大鼠睾丸重量、血清睾酮较N组都有统计学意义下降（P<0.05,P<0.05）。睾丸免疫组化显示PCNA免疫阳性物呈棕黄色颗粒,主要是精原细胞和初级精母细胞,支持细胞也有着色；EGFR在精母细胞、精子细胞、间质细胞和支持细胞均呈阳性反应。A、B组大鼠睾丸PCNA和EGFR阳性率明显低于N组大鼠（P<0.05, P<0.05）, PCNA和EGFR与血糖呈负相关,相关系数r分别为-0.665（P<0.05）,-0.540 （P=0.002）; PCNA, EGFR与睾丸重量呈正相关,相关系数分别为r=0.496（P=0.009）,r=0.454（P=0.012）; PCNA、EGFR与血清睾酮水平呈正相关,相关系数分别是r=0.574（P=0.001）,r=0.428（P=0.018）。结论：（1）脂肪乳灌胃（高糖高脂饮食）7周加小剂量一次尾静脉注射STZ可以成功诱导SD大鼠的2型糖尿病模型,方法可靠,可全部成模；（2）PCNA及EGFR在糖尿病雄性SD大鼠睾丸组织的表达较正常组雄性SD大鼠睾丸组织表达显着减少；（3）糖尿病雄性SD大鼠睾丸的重量及血清睾酮的水平较正常组大鼠是显着减少；（4）SD雄性大鼠睾丸组织PCNA及EGFR表达与血糖是呈负相关的；（5）大鼠睾丸PCNA、EGFR表达与睾丸重量及血清睾酮水平呈正相关。总之,PCNA及EGFR在糖尿病雄性SD大鼠睾丸表达减少,通过各种可能的途径影响了睾丸生精和睾酮分泌,并导致睾丸重量下降,可能随糖尿病病情的加重而恶化,从而成为导致T2DM雄性大鼠生殖系统功能障碍可能的机制之一。
彭弋峰,徐东亮,仲皖,方祥,盛世乐,卢林明,徐国祥,陆仁康[10]（2003）在《大鼠血清表皮生长因子和睾丸表皮生长因子受体与精子生成的相关性》文中指出目的 探讨血清表皮生长因子 （ EGF）和睾丸组织表皮生长因子受体 （ EGF-R）与大鼠精子生成的关系。 方法 40只性成熟期雄性 SD大鼠 ,随机分为假手术组（ SOG）、去颌下腺组 （ SG）、去颌下腺加腹腔注射 EGF I组 （ SG-EGF I）和 II组 （ SG-EGFII） ,每组 1 0只。SG-EGF I和 SG-EGF II分别腹腔内注射 EGF0 .2 5和 0 .50 μg·kg- 1·d- 1。大鼠常规喂养 48d,断头取血和睾丸。放射免疫法检测血清 EGF水平 ,病理检查睾丸生精功能和免疫组织化学检测睾丸组织 EGF-R的表达。 结果 大鼠血清 EGF水平SG-EGF I组明显下降 （ P<0 .0 5） ,SG组有非常显着下降 （ P<0 .0 1 ） ;睾丸生精功能中、重度障碍 ;间质细胞 EGF-R表达明显减少 （ P<0 .0 5）。补充不同剂量的 EGF对睾丸生精功能有不同影响。 SOG、SG-EGF I和 SG-EGF II大鼠睾丸生精细胞、支持细胞及间质细胞 EGF-R表达无显着性差异 （ P>0 .0 5）。 结论 EGF对精子发生具重要的调控作用 ,血清 EGF水平和睾丸间质细胞 EGF-R高表达与睾丸生精功能呈正相关
二、The correlation between serum epidermal growth factor/testicular epidermal growth factor receptor and spermatogenesis in rat（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The correlation between serum epidermal growth factor/testicular epidermal growth factor receptor and spermatogenesis in rat（论文提纲范文）
（1）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源与精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞的应用 |
| 1.2.3 精原干细胞的移植 |
| 1.2.4 受体的制备 |
| 1.2.5 CRSPR/Cas9 技术的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 内源性精子发生消融的小鼠模型制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂与配置 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 F_0代小鼠获得及基因型鉴定 |
| 2.2.2 F_1代新生小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 Western blot鉴定ETV5 蛋白的缺失 |
| 2.2.4 不同基因型小鼠体重的检测 |
| 2.2.5 不同基因型小鼠睾丸重的检测 |
| 2.2.6 睾丸组织形态学比较 |
| 2.2.7 附睾中精子的检测 |
| 2.2.8 精子发生相关基因的表达 |
| 2.2.9 睾酮水平检测 |
| 2.2.10 繁殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的分离培养与检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备与耗材 |
| 3.1.3 主要试剂与配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 用小鼠胎儿成纤维细胞制备饲养层细胞 |
| 3.2.2 两种饲养层培养SSCs细胞体外增殖的比较 |
| 3.2.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 3.2.4 添加不同生长因子对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 3.2.5 精原干细胞体外增殖的碱性磷酸酶染色 |
| 3.2.6 精原干细胞体外增殖的免疫荧光染色 |
| 3.2.7 精原干细胞的标志基因表达检测 |
| 3.2.8 精原干细胞标志基因表达水平的实时定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 精原干细胞移植与精子来源的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与配制 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SSCs的移植 |
| 4.2.2 移植后睾丸重量的检测 |
| 4.2.3 睾丸的组织形态观察(H.E.染色) |
| 4.2.4 睾丸切片的免疫组织化学分析 |
| 4.2.5 附睾精子的检测 |
| 4.2.6 精子来源的检测 |
| 4.2.7 精子发生相关基因的表达 |
| 4.2.8 繁殖能力评估 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因敲除猪受体模型的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验设备与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与配制 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pX330-gRNA质粒的构建 |
| 5.2.2 质粒电转猪胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.3 电转后单克隆细胞团的收取 |
| 5.2.4 单克隆细胞团敲除方式的鉴定 |
| 5.2.5 ETV5 基因纯合敲除细胞系的获得 |
| 5.2.6 SCNT制备ETV5 基因敲除克隆猪 |
| 5.2.7 新生克隆猪的基因型鉴定 |
| 5.2.8 新生克隆猪ETV5 蛋白Western blot鉴定 |
| 5.2.9 睾丸发育的组织形态检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 全文总结与主要结论 |
| 6.2 主要创新点与后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要英文对照缩略表 |
| 附录2 全文 RT-PCR(Q-PCR)引物序列 |
| 附录3 细胞系测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略表 |
| 第一章 综述 |
| 1.骆驼的生殖生理 |
| 1.1 骆驼的分类及分布 |
| 1.2 骆驼的生殖特性 |
| 1.3 骆驼生殖生理 |
| 2 视黄醇及其代谢过程 |
| 2.1 视黄醇与动物生殖 |
| 2.2 视黄醇结合蛋白RBP的研究进展 |
| 2.3 视黄醇结合蛋白的作用机理 |
| 2.4 视黄醇结合蛋白在生殖疾病方面的研究 |
| 3 钙离子及其代谢过程研究进展 |
| 3.1 钙离子的功能 |
| 3.2 钙离子与生殖 |
| 3.3 钙离子与钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ |
| 3.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的生理功能 |
| 3.5 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与生殖相关疾病的关系 |
| 4 本实验的研究目的意义及创新点 |
| 第二章 双峰驼血清差异蛋白的筛选与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 血清蛋白的提取 |
| 1.3.2 过滤辅助样品制备(FASP)消解 |
| 1.3.3 iTRAQ标记和SCX分馏 |
| 1.3.4 LC-MS/MS分析 |
| 1.3.5 数据分析 |
| 1.3.6 血清RNA的提取及qPCR反应 |
| 1.3.7 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹 |
| 1.3.8 统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 双峰驼血清iTRAQ分析 |
| 2.2 鉴定差异表达蛋白 |
| 2.3 聚类分析和蛋白质间互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 qPCR和 Western blot验证表达谱 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 维生素A结合蛋白(RBP4)对AR的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞原代培养 |
| 1.2.2 体外细胞处理和转染 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 免疫组织化学染色 |
| 1.2.5 免疫荧光染色 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RBP4 基因在双峰驼各组织的mRNA检测 |
| 2.2 RBP4在双峰驼性腺轴的检测 |
| 2.3 不同浓度VitA对其受体,结合蛋白(RBP4)及IGFs的影响 |
| 2.4 RBP4过表达载体的构建及其酶切鉴定 |
| 2.5 支持细胞转染过表达p-EGFP-RBP4 的效果检测 |
| 2.6 过表达RBP4对IGFs及类固醇激素合成的影响 |
| 2.7 siRNA-RBP4 的合成及沉默效率检测 |
| 2.8 沉默RBP4对IGFs及类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 双峰驼精清诱导排卵后卵巢差异蛋白质筛选 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物和处理条件 |
| 1.2.2 精液收集和精清制备 |
| 1.2.3 精清注射及血清样品收集 |
| 1.2.4 样品的采集 |
| 1.2.5 qRT-PCR和 RT-PCR |
| 1.2.6 蛋白质印迹 |
| 1.2.7 组织免疫荧光染色 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 卵泡直径和血清激素水平 |
| 2.2 蛋白质分析 |
| 2.3 差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)分析 |
| 2.5 表达谱验证 |
| 2.6 组织表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CAMK2G通过类固醇通路调控ER的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度抑制剂处理细胞 |
| 1.2.2 细胞转染及其它方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CAMK2G的表达分析 |
| 2.2 过表达载体p-EGFP-CAMK2G酶切验证 |
| 2.3 双峰驼颗粒细胞转染过表达p-EGFP-CAMK2G的效果检测 |
| 2.4 过表达CAMK2G对各受体的影响 |
| 2.5 过表达CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.6 siRNA-CAMK2G沉默效率的检测 |
| 2.7 敲低CAMK2G对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.8 敲低CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.9 抑制剂KN-93对CAMK2G的影响 |
| 2.10 抑制剂KN-93对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.11 抑制剂KN-93对类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（4）乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 少肌症 |
| 1.2.1 少肌症发病的影响因素 |
| 1.2.2 少肌症的治疗 |
| 1.3 骨骼肌修复和再生的分子机制 |
| 1.3.1 骨骼肌发育和再生 |
| 1.3.2 成肌细胞 |
| 1.3.3 成肌细胞增殖与分化的分子机制 |
| 1.4 乳脂肪球表皮生长因子-8(MFG-E8) |
| 1.4.1 MFG-E8来源和性质 |
| 1.4.2 MFG-E8的功能性 |
| 1.5 少肌症预防及治疗的国内外研究现状 |
| 1.5.1 激素治疗 |
| 1.5.2 营养素干预 |
| 1.5.3 MFG-E8对预防和治疗老年少肌症的潜在作用途径 |
| 1.6 本论文主要研究内容和技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 测定方法 |
| 2.2.1 蛋白质测定 |
| 2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量 |
| 2.2.3 小鼠C_2C_(12)成肌细胞培养 |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 LC-MS/MS测定蛋白质组成 |
| 2.2.6 MFG-E8二级结构的测定 |
| 2.2.7 细胞周期的测定 |
| 2.2.8 细胞凋亡的测定 |
| 2.2.9 荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.2.10 激光共聚焦(CLSM)观察细胞形态 |
| 2.2.11 透射电子显微镜(TEM)观察细胞器结构 |
| 2.2.12 组织病理学分析 |
| 2.2.13 q RT-PCR测定生长调控因子的基因表达 |
| 2.2.14 Western blot分析蛋白表达和磷酸化表达 |
| 2.3 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白分离和结构表征 |
| 2.3.1 乳脂肪球膜蛋白的提取 |
| 2.3.2 DEAE-52柱色谱分离乳脂肪球膜蛋白 |
| 2.3.3 乳脂肪球膜蛋白馏分的鉴定 |
| 2.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化作用 |
| 2.4.1 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的增殖作用 |
| 2.4.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的分化作用 |
| 2.5 C_2C_(12)细胞差异蛋白组分析 |
| 2.6 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖作用途径研究 |
| 2.6.1 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路关键性基因的调控作用 |
| 2.6.2 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路关键性蛋白表达的作用 |
| 2.7 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化作用机制研究 |
| 2.7.1 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖 |
| 2.7.2 MFG-E8对生长调节基因的表达 |
| 2.7.3 MFG-E8对PI3K信号通路关键蛋白磷酸化的作用 |
| 2.7.4 MFG-E8 对成肌调节因子m RNA的调控作用 |
| 2.7.5 MFG-E8对成肌调节因子蛋白表达作用 |
| 2.8 MFG-E8体外稳定性和安全性试验 |
| 2.8.1 MFG-E8在模拟胃液和肠液中的稳定性 |
| 2.8.2 MFG-E8对Caco-2 细胞毒性实验 |
| 2.9 老年少肌症大鼠模型的构建 |
| 2.10 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生作用 |
| 2.10.1 动物试验分组 |
| 2.10.2 大鼠病理指标分析 |
| 2.10.3 大鼠腓肠肌生长调控因子分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 第3章 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白筛选及其结构表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 乳脂肪球膜蛋白的SDS-PAGE |
| 3.3 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白组分的筛选 |
| 3.3.1 不同浓度洗脱液对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.3.2 不同pH洗脱液对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.3.3 洗脱速率对乳脂肪球膜蛋白组分的分离 |
| 3.4 促C_2C_(12)细胞增殖的乳脂肪球膜蛋白馏分的组成和结构 |
| 3.4.1 促C_2C_(12) 细胞增殖的脂肪球膜蛋白馏分的SDS-PAGE |
| 3.4.2 促C_2C_(12) 细胞增殖的脂肪球膜蛋白馏分MALDI-TOF/TOF分析 |
| 3.4.3 乳脂肪球表皮生长因子-8(MFG-E8)相对定量分析 |
| 3.5 MFG-E8的结构特征 |
| 3.5.1 MFG-E8的氨基酸序列 |
| 3.5.2 MFG-E8的二级结构 |
| 3.5.3 MFG-E8的三级结构 |
| 3.5.4 MFG-E8跨膜区 |
| 3.5.5 MFG-E8亲/疏水性 |
| 3.5.6 MFG-E8磷酸化和糖基化位点 |
| 3.5.7 MFG-E8的结构域 |
| 3.6 MFG-E8的生物学特性 |
| 3.6.1 MFG-E8的生物学功能分析 |
| 3.6.2 MFG-E8的作用途径分析 |
| 3.6.3 与C_2C_(12)相关的作用途径分析 |
| 3.7 本章小节 |
| 第4章 细胞差异蛋白组及MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖与分化的作用途径 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖作用 |
| 4.2.1 MFG-E8对细胞活性的影响 |
| 4.2.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞周期的影响 |
| 4.2.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞形态和结构的影响 |
| 4.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化及融合成多核肌管的作用 |
| 4.3.1 C_2C_(12)细胞分化过程中形态变化 |
| 4.3.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化初期的作用 |
| 4.3.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化中期的作用 |
| 4.3.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞分化后期和细胞融合作用 |
| 4.4 C_2C_(12)细胞差异表达蛋白质组 |
| 4.4.1 C_2C_(12)细胞蛋白质组基本信息 |
| 4.4.2 差异表达蛋白的功能注释 |
| 4.4.3 功能性差异蛋白分类及筛选 |
| 4.4.4 功能性蛋白的生物学作用 |
| 4.5 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞增殖和抑制作用的分子机制 |
| 4.5.1 功能性蛋白对C_2C_(12)细胞增殖和抑制作用途径 |
| 4.5.2 MFG-E8对生长调控基因的调节作用 |
| 4.5.3 MFG-E8对PI3K和 MAPK信号通路中关键蛋白的表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 MFG-E8 介导PI3K/Akt信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖与分化的分子机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖 |
| 5.2.1 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞活性的影响 |
| 5.2.2 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞内线粒体的影响 |
| 5.2.3 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞的凋亡作用 |
| 5.2.4 MFG-E8对C_2C_(12) 细胞形态的影响· |
| 5.3 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖的分子机制 |
| 5.3.1 MFG-E8对PI3K信号通路下游关键调节基因的作用 |
| 5.3.2 MFG-E8对PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的作用 |
| 5.3.3 MFG-E8 介导PI3K信号通路促C_2C_(12) 细胞增殖的分子机制 |
| 5.4 MFG-E8促C_2C_(12) 细胞分化作用的机制 |
| 5.4.1 MFG-E8对成肌调节因子基因的调控作用 |
| 5.4.2 MFG-E8对成肌调节因子的表达作用 |
| 5.4.3 C_2C_(12) 细胞分化对PI3K和 Akt磷酸化作用 |
| 5.4.4 MFG-E8 介导PI3K信号通路促细胞增殖作用的机制 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌的修复和再生作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 MFG-E8体外稳定性及安全性 |
| 6.2.1 MFG-E8在模拟胃液中稳定性 |
| 6.2.2 MFG-E8在模拟肠液中稳定性 |
| 6.2.3 MFG-E8的细胞毒性 |
| 6.3 老年少肌症大鼠模型的构建 |
| 6.3.1 模型大鼠的生理和生化指标 |
| 6.3.2 模型大鼠的组织病理学 |
| 6.4 MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的调控作用 |
| 6.4.1 MFG-E8对老年少肌症模型大鼠生理和生化指标的影响 |
| 6.4.2 MFG-E8对老年少肌症模型大鼠脏器系数的影响 |
| 6.4.3 MFG-E8对大鼠腓肠肌组织的病理变化 |
| 6.5 MFG-E8对少肌症大鼠腓肠肌修复和再生的分子机制 |
| 6.5.1 MFG-E8对PI3K信号通路关键基因的调控作用 |
| 6.5.2 MFG-E8对PI3K/Akt信号通路关键蛋白磷酸化作用 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）EGFR信号诱导HMGA2转录调控的作用及其在肝癌转移中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 引言 |
| 第一章 HMGA2促进肝癌转移 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞株、质粒和菌株 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 HMGA2在大鼠肝癌模型中表达上调 |
| 1.2.2 HMGA2不影响肝癌细胞的增殖 |
| 1.2.3 HMGA2促进肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 1.2.4 HMGA2不影响实体瘤的生长 |
| 1.2.5 HMGA2促进肝癌细胞的肺转移 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 EGFR的激活促进肝癌中HMGA2的表达 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 肝癌大鼠模型中EGFR的表达及活化情况 |
| 2.2.2 EGFR的激活介导了HMGA2的转录调控 |
| 2.2.3 MEK-ERK通路参与了EGFR介导的HMGA2转录调控 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 MEK/ERK通过磷酸化ELK1调控肝癌中HMGA2的表达 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 质粒来源及图谱 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 EGFR/ERK通路可促进肝癌细胞中ELK1的磷酸化及核转位 |
| 3.2.2 ELK1可促进HMGA2基因的转录调控 |
| 3.2.3 过表达ELK1增加了HMGA2启动子的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 综述 高迁移率族蛋白A与肿瘤的关系研究进展 |
| 参考文献 |
（6）人精原干细胞系的建立及其增殖基因调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一章 人精原干细胞系的建立 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 人精原干细胞系的建立 |
| 1.3.2 人精原干细胞系的生化表型鉴定 |
| 1.3.3 人精原干细胞系的增殖能力检测 |
| 1.3.4 人精原干细胞系在受体小鼠体内的克隆和增殖潜能 |
| 1.3.5 人精原干细胞系的染色体核型与基因检测 |
| 1.3.6 人精原干细胞系无致瘤性 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 人精原干细胞增殖的基因调控机制 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因表达谱芯片样本RNA的质量控制 |
| 2.3.2 表达谱芯片基因表达水平的相关性分析 |
| 2.3.3 表达谱芯片样本的主成分分析 |
| 2.3.4 表达谱芯片样本的差异表达基因分析 |
| 2.3.5 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 2.3.6 Bland-Altman分析评价两种方法验证差异表达基因的一致性 |
| 2.3.7 差异表达基因的KEGG通路分析 |
| 2.3.8 免疫细胞化学验证ID1蛋白在人精原干细胞系中的表达 |
| 2.3.9 Western blots验证ID1 在人精原干细胞系中的表达 |
| 2.3.10 人精原干细胞系ID1 基因的si RNA干扰效果检测 |
| 2.3.11 不同生长因子作用下的ID1在人精原干细胞系中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1.攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 附录2.攻读博士学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（7）小鼠雌性生殖干细胞的分离及其生物学特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 哺乳动物雄性生殖干细胞研究概况 |
| 1.1 干细胞的定义 |
| 1.2 哺乳动物精原干细胞 |
| 1.3 生殖干细胞的分离技术 |
| 2 哺乳动物雌性生殖干细胞概况 |
| 2.1 卵子发生 |
| 2.2 小鼠卵巢中卵泡更新 |
| 2.3 小鼠雌性生殖干细胞的分离 |
| 2.4 小鼠雌性生殖干细胞的组织定位 |
| 2.5 小鼠雌性生殖干细胞基因表达谱特征 |
| 2.6 小鼠雌性生殖干细胞多能性转变 |
| 2.7 雌性生殖干细胞移植 |
| 2.8 雌性生殖干细胞分离方法争议 |
| 2.9 卵巢中是否存在其它类型生殖干细胞 |
| 3 GDNF-GFRAl-RET通路概况 |
| 3.1 GDNF-GFRAl-RET通路概述 |
| 3.2 GDNF通路与疾病 |
| 3.3 GDNF通路与精子发生 |
| 3.4 GDNF通路与卵巢发育 |
| 4 本论文研究的目的与意义 |
| 第二章 贴壁法分离雌性生殖干细胞及其生物学特性分析 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 小鼠品系 |
| 2.2 常用试剂及来源 |
| 2.3 STO细胞培养和传代 |
| 2.4 STO细胞冻存 |
| 2.5 STO细胞复苏 |
| 2.6 组织和细胞RNA提取 |
| 2.7 RNA反转录 |
| 2.8 STO饲养层细胞的制作 |
| 2.9 小鼠雌性生殖细胞分离 |
| 2.10 小鼠雌性生殖干细胞的纯化 |
| 2.11 细胞免疫荧光 |
| 2.12 细胞和组织HE染色 |
| 2.13 组织冰冻切片 |
| 2.14 RT-PCR |
| 2.15 雌性生殖细胞培养基配制 |
| 2.16 雌性生殖细胞换液和传代操作 |
| 2.17 细胞核型分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 多次贴壁法从卵巢中分离雌性生殖干细胞 |
| 3.2 不同鼠龄卵巢原代中雌性生殖干细胞数目差异 |
| 3.3 雌性生殖干细胞表达谱和核型分析 |
| 3.4 雌性干生殖细胞细胞连接现象 |
| 3.5 生长因子对生殖干细胞增殖影响 |
| 3.6 细胞密度对生殖干细胞增殖影响 |
| 3.7 雌二醇(E2)对雌性生殖细胞的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 多次贴壁法分离雌性生殖干细胞有效性 |
| 4.2 雌性生殖干细胞数目与小鼠鼠龄密切相关 |
| 4.3 雌性生殖生殖干细胞的细胞连接现象 |
| 4.4 GDNF缺失对生殖干细胞的影响 |
| 4.5 GDNF与E2对小鼠雌性生殖干细胞的影响 |
| 5. 小结 |
| 第三章 Gfra1启动子的转录调控研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 细胞系及小鼠品系 |
| 2.2 常用试剂及来源 |
| 2.3 小鼠睾丸原代Sertoli细胞制作 |
| 2.4 细胞培养和分孔 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 荧光素酶活性测定实验 |
| 2.7 启动子转录因子结合位点预测 |
| 2.8 大肠杆菌感受态制作及质粒转化 |
| 2.9 载体构建 |
| 2.10 质粒提取 |
| 2.11 基因组DNA提取 |
| 2.12 Gfra1启动子截短质粒构建 |
| 2.13 DMRT1位点及SP1位点突变载体构建 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 小鼠Gfra1基因启动子区转录因子预测 |
| 3.2 小鼠Gfra1基因启动子区DMRT1蛋白结合位点分析 |
| 3.3 Gfra1基因启动子截短分析 |
| 3.4 DMRT1对Gfra1启动子转录调控 |
| 3.5 转录因子SP1、GATA1等对Gfra1启动子的转录调控作用 |
| 3.6 雌二醇E2及雌激素受体蛋白ESR1对Gfra1启动子转录调控 |
| 3.7 SP1位点突变影响E2-ESR1对Gfra1启动子转录调控 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 Gfra1基因在雄性性腺中受DMRT1和SP1的调控 |
| 4.2 雌性中Gfra1基因受E2雌二醇和雌激素受体蛋白ESR1调控 |
| 4.3 E2雌二醇和雌激素受体蛋白ESR1对Gfra1的调控依赖SP1位点 |
| 5. 小结 |
| 第四章 免疫磁珠分离雌性生殖干细胞及生物特征 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 小鼠卵巢两步消化 |
| 2.2 免疫磁珠分选 |
| 2.3 雌性生殖干细胞培养体系 |
| 2.4 拟配体形成实验 |
| 2.5 细胞免疫荧光 |
| 2.6 细胞RNA的提取和逆转录 |
| 2.7 细胞计数 |
| 2.8 雌性生殖干细胞传代 |
| 2.9 细胞核型分析 |
| 2.10 细胞HE染色 |
| 2.11 RT-PCR |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 免疫磁珠分选卵巢VASA细胞 |
| 3.2 VASA细胞特征 |
| 3.3 VASA雌性生殖干细胞分化现象 |
| 3.4 雌性生殖干细胞胚胎干细胞类似克隆 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 VASA抗体能有效分离雌性生殖干细胞 |
| 4.2 VASA~+细胞的分化潜能 |
| 5. 小结 |
| 研究总结 |
| 中英文对照表 |
| 在读期间发表论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 小鼠精原干细胞与支持细胞研究进展 |
| 1.1 小鼠精原干细胞的研究进展 |
| 1.1.1 小鼠精原干细胞的发生 |
| 1.1.2 小鼠精原细胞的类型 |
| 1.1.3 小鼠精原干细胞的生物学特性 |
| 1.1.4 小鼠精原干细胞的生理学特性 |
| 1.1.5 小鼠精原干细胞的形态学特征 |
| 1.1.6 小鼠精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.1.7 小鼠精原干细胞的鉴定、培养、诱导与冷冻保存 |
| 1.2 饲养层支持细胞的研究进展 |
| 1.2.1 小鼠睾丸支持细胞的生物学特性 |
| 1.2.2 小鼠饲养层支持细胞的功能 |
| 1.2.3 小鼠睾丸支持细胞与精原干细胞的关系 |
| 1.2.4 小鼠睾丸支持细胞的分离 |
| 1.2.5 小鼠睾丸支持细胞的鉴定 |
| 1.2.6 小鼠睾丸支持细胞的体外培养 |
| 1.3 促生长因子对精原干细胞增殖作用的影响 |
| 1.3.1 LIF 对精原干细胞体外增殖作用的影响 |
| 1.3.2 GDNF 对小鼠精原干细胞体外增殖作用的影响 |
| 1.4 小鼠精原干细胞体外培养研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 小鼠精原干细胞的分离与纯化研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物及处理 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 设备与器械 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 小鼠睾丸单细胞悬液的制备 |
| 2.2.2 台盼蓝拒染法检测细胞活率 |
| 2.2.3 四次反复差速贴壁法分离纯化精原干细胞 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 形态学观察 |
| 2.3.2 台盼蓝染色 |
| 2.3.3 碱性磷酸酶（AKP）染色 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 两步酶消化法获取睾丸单细胞悬液 |
| 2.4.2 精原干细胞常用的分离纯化方法 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的鉴定研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物及处理 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 设备与器械 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小鼠睾丸单细胞悬液的制备 |
| 3.2.2 小鼠睾丸支持细胞的制备 |
| 3.2.3 四次反复差速贴壁分离纯化小鼠精原干细胞 |
| 3.2.4 小鼠精原干细胞（SSCs）的形态学鉴定 |
| 3.2.5 碱性磷酸酶（AKP）染色 |
| 3.2.6 Beta-actin 和 N9113 基因RNA 分离提取和RT-PCR |
| 3.2.7 引物设计 |
| 3.2.8 PCR 扩增 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.3.1 形态学鉴定 |
| 3.3.2 碱性磷酸酶（AKP）染色结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 小鼠精原干细胞体外培养研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物及处理 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 设备与器械 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.1.5 小鼠睾丸液的制备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 基础培养液 |
| 4.2.2 培养液Ⅰ |
| 4.2.3 培养液Ⅱ |
| 4.2.4 试验处理方式 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 试验结果与分析 |
| 4.4.1 单因子培养对精原干细胞的增殖作用 |
| 4.4.2 双因子配伍培养对精原干细胞的增殖作用 |
| 4.4.3 三因子配伍培养对精原干细胞的增殖作用 |
| 4.4.4 睾丸液对小鼠精原干细胞增殖的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 小鼠精原干细胞冷冻研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物及处理 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 设备与器械 |
| 5.1.4 试剂配制 |
| 5.1.5 LDL 的制备 |
| 5.1.6 LDL 溶液的配制 |
| 5.1.7 卵磷脂溶液的配制 |
| 5.1.8 海藻糖溶液的配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 冷冻保护剂 |
| 5.2.2 精原干细胞的冷冻方法 |
| 5.3 统计分析 |
| 5.4 试验结果与分析 |
| 5.4.1 不同冷冻保护剂对小鼠精原干细胞冷冻复苏率的影响 |
| 5.4.2 不同冷冻保护剂配伍对小鼠精原干细胞冷冻复苏率的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）PCNA、EGFR在2型糖尿病雄性SD大鼠睾丸组织的表达及相关因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 PCNA、EGFR表达对糖尿病睾丸功能的影响 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）大鼠血清表皮生长因子和睾丸表皮生长因子受体与精子生成的相关性（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 一、实验动物与分组 |
| 二、实验方法 |
| 1.麻醉和手术: |
| 2.饲养条件与方法: |
| 三、标本采集和检测 |
| 1.标本采集: |
| 2.血清EGF测定: |
| 3.睾丸生精功能的病理检查: |
| 4.睾丸组织EGF-R表达: |
| 四、统计学方法 |
| 结果 |
| 一、各组大鼠血清EGF浓度 |
| 二、各组大鼠睾丸生精功能 |
| 三、各组大鼠睾丸生精、支持和间质细胞中EGF-R表达与分布 |
| 讨论 |
四、The correlation between serum epidermal growth factor/testicular epidermal growth factor receptor and spermatogenesis in rat（论文参考文献）
- [1]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [2]内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究[D]. 张仙玉. 湖南农业大学, 2020
- [3]双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究[D]. 王琪. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [4]乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制[D]. 李贺. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [5]EGFR信号诱导HMGA2转录调控的作用及其在肝癌转移中的机制研究[D]. 雷佳. 郑州大学, 2019(02)
- [6]人精原干细胞系的建立及其增殖基因调控的研究[D]. 侯晶玫. 上海交通大学, 2016
- [7]小鼠雌性生殖干细胞的分离及其生物学特征研究[D]. 刘靖. 武汉大学, 2017(12)
- [8]小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究[D]. 凡志国. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [9]PCNA、EGFR在2型糖尿病雄性SD大鼠睾丸组织的表达及相关因素分析[D]. 孔艳. 天津医科大学, 2010(03)
- [10]大鼠血清表皮生长因子和睾丸表皮生长因子受体与精子生成的相关性[J]. 彭弋峰,徐东亮,仲皖,方祥,盛世乐,卢林明,徐国祥,陆仁康. 生殖医学杂志, 2003(02)