基于CRISPR/Cas9系统研究日本乙型脑炎病毒复制增殖相关的宿主蛋白

论文摘要

日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）,简称乙脑病毒,属于单股正义链RNA病毒,病毒基因组较小,病毒结构较为简单,必须利用宿主蛋白完成自身复制增殖。前期研究发现宿主蛋白锌指蛋白ZNF251与α2巨球蛋白α2M是病毒NS1蛋白的潜在互作蛋白,CRBN蛋白、蛋白磷酸酯酶PPP2CB与腓骨蛋白FBLN-5是病毒NS3的潜在互作蛋白。本研究旨在验证上述宿主蛋白对乙脑病毒的复制增殖是否有影响,进一步揭示宿主蛋白在乙脑病毒增殖与复制中发挥的作用。首先,构建针对上述蛋白的293单基因敲除细胞系。研究中成功运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建针对ZNF251、α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5和HSP70的293单基因敲除细胞系,并通过测序和Western Blotting鉴定正确;之后,发现ZNF251基因的缺失正向调节了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平,而除HSP70外的其他基因的缺失对JEV的mRNA和子代病毒粒子水平无影响。使用反转录荧光定量和噬斑形成实验,发现在敲除ZNF251基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平约为对照组的2.4倍,而在敲除除HSP70外的其他基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平与对照组的差异不显;敲除ZNF251基因的293细胞接种JEV后,子代病毒滴度平均值约为lg8.67 PFU/ml,高于对照的lg7.80 PFU/ml,而在敲除除HSP70外其他基因的293细胞上,子代病毒滴度平均值与对照组差异不明显。综上结果证实了CRISPR/Cas9可以成功运用在293细胞上进行基因编辑并进行JEV的相关研究,并通过在各敲除细胞系上的研究,筛选出293细胞的宿主蛋白ZNF251是一种对JEV的增殖与复制有影响的宿主蛋白,ZNF251可能对JEV在293细胞中的复制增殖有一定的抑制作用,而α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5基因对于JEV在293细胞中的复制增殖无明显影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1 乙型脑炎病毒概况
•   2 宿主蛋白参与黄病毒复制增殖研究
•     2.1 参与黄病毒入侵与信号转导的宿主蛋白研究
•     2.2 参与黄病毒复制的宿主蛋白研究
•     2.3 参与黄病毒组装与释放的宿主蛋白研究
•   3 本研究的宿主蛋白研究现状
•     3.1 锌指蛋白的结构和功能
•     3.2 α2巨球蛋白的结构和功能
•     3.3 CRBN的结构和功能
•     3.4 蛋白磷酸酯酶的结构和功能
•     3.5 腓骨蛋白-5的结构和功能
•   4 CRISPR/CAS9 基因编辑技术的研究及应用
•     4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的原理
•     4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的应用
•   5 本研究目的与意义
• 第二章 缺失细胞的构建及其对乙脑病毒MRNA和病毒粒子水平的影响
•   1 材料与方法
•     1.1 材料
•     1.2 实验方法
•   2 结果与分析
•     2.1 CRISPR/Cas9 重组真核表达质粒
•     2.2 CRISPR/Cas9 细胞敲除稳定株的筛选
•     2.3 CRISPR/Cas9 细胞敲除稳定株的鉴定
•     2.4 JEV在293 缺失细胞上的相对mRNA水平变化
•     2.5 JEV在293 缺失细胞上的病毒粒子变化
•   3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱君海

导师: 曹三杰

关键词: 日本乙型脑炎,宿主蛋白

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技,医药卫生科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,基础医学

单位: 四川农业大学

基金: 国家重点研发计划课题三“重要神经嗜性人兽共患病免疫与致病机制研究”(课题编号:2016YFD0500403)

分类号: R373;S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.001006

总页数: 52

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