杜氏盐藻β-胡萝卜素合成研究

论文摘要

β-胡萝卜素（β-carotene）是维生素A的前体物质,具有抗氧化、增强免疫力、抑制心脑血管疾病、预防癌症等作用,在医药、保健、食品、化妆品等行业应用广泛。杜氏盐藻（Dunaliella salina）是一种可以大量累积β-胡萝卜素的微藻,也是研究类胡萝卜素合成的理想模式生物。从分子生物学角度探究杜氏盐藻积累β-胡萝卜素的分子机制,借助相关分子遗传育种手段提高β-胡萝卜素产量,极具研究价值。本文主要研究内容和结果如下:1、结合毛细管分离法、平板划线法得到单个杜氏藻细胞,再利用抗生素除菌法除菌;对藻株FACHB-435和GY-H13进行鉴定,确定这两株藻属于杜氏藻属;通过流式细胞仪预估这两株杜氏藻的基因组大小分别约为385 Mb和255 Mb;二代测序结果显示杜氏盐藻FACHB-435基因组大小约为368 Mb,与预估大小相近。2、通过分子生物学手段,克隆得到两株杜氏藻LCYB和PSY基因的CDS序列,其中FACHB-435和GY-H13 LCYB基因CDS大小分别为1809 bp、1794 bp,与Ds-FACHB-847 LCYB基因（KX218392.1）同源性分别为89%、99%;GY-H13 PSY基因CDS大小为1275 bp,与Db-847 PSY基因（EU328287.1）同源性达99%。构建过表达质粒转入两株杜氏藻,筛选成功转化的藻株。其中FACHB-435 LCYB基因过表达藻株DsF-L11β-胡萝卜素含量较野生株提高了14.06%（P<0.05）;GY-H13LCYB基因过表达藻株DsG-L5、DsG-L7、DsG-L10β-胡萝卜素含量分别较野生株提高了37.16%、29.97%、98.55%（P<0.05）;GY-H13 PSY基因过表达藻株DsG-P15、DsG-P28β-胡萝卜素含量分别较野生株提高了67.2%、58.22%（P<0.05）。3、探究高盐、高光、-N、-P、-S对杜氏盐藻β-胡萝卜素积累的影响,结果发现高盐、高光、-N、-P、-S条件下β-胡萝卜素含量较对照最高分别提高了31.31%、30.29%、59.68%、50.84%、48.44%。通过ARTP诱变育种实验,筛选出生长速率快且β-胡萝卜素产量相对较高的突变藻株,其中突变株DF14、DF15β-胡萝卜素产量分别是野生株的2.06、2.28倍,DG15、DG17β-胡萝卜素产量分别是野生株的1.98、1.90倍。4、利用转录组测序技术探究杜氏盐藻响应高光胁迫的转录组学规律。将clean reads与杜氏盐藻参考全基因组、eggNOG、KEGG、KOG数据库进行比对。比较实验组和对照组在相邻两个培养时间点之间的差异表达基因,其中对照组5dVs13d中上调基因6142个,下调基因3949个,实验组5d-HLVs13d-HL上调基因8466个,下调基因2969个。与5d Vs13d结果相比,5d-HLVs13d-HL KEGG差异基因富集在类胡萝卜素代谢途径中的基因大多为上调基因,且单个细胞的β-胡萝卜素含量高于对照组,进一步说明高光胁迫对杜氏盐藻类胡萝卜素的合成具有一定的促进作用。选择3个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果与预测的一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
•   1.1 β-胡萝卜素简介
•     1.1.1 β-胡萝卜素的结构和性质
•     1.1.2 β-胡萝卜素的功能和应用
•     1.1.3 β-胡萝卜素的生物合成
•   1.2 杜氏盐藻简介
•     1.2.1 杜氏盐藻概述
•     1.2.2 影响杜氏盐藻β-胡萝卜素积累的主要因素
•     1.2.3 杜氏盐藻的应用和前景
•     1.2.4 杜氏盐藻研究现状
•   1.3 杜氏盐藻转录组学研究进展
•   1.4 杜氏盐藻诱变育种研究进展
•   1.5 本课题研究的目的、内容和技术路线
•     1.5.1 本课题研究的目的
•     1.5.2 本课题主要研究内容
•     1.5.3 本课题研究的技术路线
• 第一章 杜氏盐藻的纯化、无菌化、鉴定及基因组大小的预测
•   1.1 实验材料
•     1.1.1 藻种
•     1.1.2 主要实验试剂与测序服务
•     1.1.3 培养基与试剂的配制
•     1.1.4 主要仪器设备
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 杜氏盐藻的培养
•     1.2.2 杜氏盐藻的纯化
•     1.2.3 杜氏盐藻的无菌化培养
•     1.2.4 杜氏盐藻的形态学鉴定
•     1.2.5 杜氏盐藻的分子生物学鉴定
•     1.2.6 杜氏盐藻基因组大小的预测
•     1.2.7 杜氏盐藻FACHB-435 的二代基因组大小评估
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 杜氏盐藻的细胞密度与光吸收值的对应关系
•     1.3.2 杜氏盐藻的生长曲线
•     1.3.3 杜氏盐藻纯化实验结果
•     1.3.4 杜氏盐藻无菌化培养结果
•     1.3.5 杜氏盐藻的形态学基本特征
•     1.3.6 杜氏盐藻分子生物学鉴定结果
•     1.3.7 杜氏盐藻基因组大小的预测结果
•     1.3.8 杜氏盐藻FACHB-435 的二代基因组大小评估结果
•   1.4 小结与讨论
• 第二章 杜氏盐藻LCYB基因和PSY基因c DNA的分子克隆及过表达
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 藻种
•     2.1.2 主要试剂和测序服务
•     2.1.3 培养基与试剂配制
•     2.1.4 主要仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 杜氏盐藻的培养
•     2.2.2 β-胡萝卜素的提取和定量分析
•     2.2.3 杜氏盐藻总RNA（DNA free）的提取
•     2.2.4 cDNA第一链的获得
•     2.2.5 杜氏盐藻LCYB基因和PSY基因的克隆
•     2.2.6 过表达载体PHK330 的改造
•     2.2.7 过表达载体PHK-GFP-LCYB和 PHK-GFP-PSY的构建
•     2.2.8 过表达载体PHK-GFP-LCYB和 PHK-GFP-PSY的转化
•     2.2.9 杜氏盐藻LCYB和 PSY基因过表达藻株的筛选与鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 β-胡萝卜素的检测结果
•     2.3.2 杜氏盐藻总RNA的提取与检测
•     2.3.3 杜氏盐藻LCYB和 PSY基因的克隆
•     2.3.4 过表达载体PHK330 的改造
•     2.3.5 过表达载体PHK-GFP-LCYB和 PHK-GFP-PSY的构建
•     2.3.6 杜氏盐藻博来霉素抗性筛选结果
•     2.3.7 杜氏盐藻LCYB和 PSY基因过表达藻株的筛选鉴定结果
•     2.3.8 杜氏盐藻转化藻株β-胡萝卜素含量的测定
•   2.4 小结与讨论
• 第三章 条件胁迫对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响及ARTP诱变育种
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 藻种
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 培养基和试剂配制
•     3.1.4 主要仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 杜氏盐藻的常规培养
•     3.2.2 两种培养基对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响
•     3.2.3 盐度对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响
•     3.2.4 光照强度对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响
•     3.2.5 营养元素缺失对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响
•     3.2.6 ARTP诱变对杜氏盐藻生长和β-胡萝卜素积累的影响
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 两种培养基下杜氏盐藻的生长和β-胡萝卜素的积累
•     3.3.2 不同盐度条件下杜氏盐藻的生长和β-胡萝卜素的积累
•     3.3.3 不同光照强度条件下杜氏盐藻的生长和β-胡萝卜素的积累
•     3.3.4 营养元素缺失条件下杜氏盐藻的生长和β-胡萝卜素的积累
•     3.3.5 ARTP诱变处理对杜氏盐藻的生长和β-胡萝卜素积累的影响
•   3.4 小结与讨论
• 第四章 杜氏盐藻FACHB-435 响应高光胁迫的转录组分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 藻种
•     4.1.2 主要试剂和测序服务
•     4.1.3 培养基
•     4.1.4 主要仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 杜氏盐藻的高光胁迫培养及β-胡萝卜素的检测
•     4.2.2 杜氏盐藻总RNA的提取与检测
•     4.2.3 cDNA文库的构建和测序
•     4.2.4 转录组测序数据的分析流程
•     4.2.5 生物信息学分析
•     4.2.6 差异表达基因的鉴定及分析
•     4.2.7 差异表达基因GO功能富集
•     4.2.8 差异表达基因KEGG代谢通路富集
•     4.2.9 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 高光条件下杜氏盐藻FACHB-435的β-胡萝卜素含量
•     4.3.2 转录组总RNA提取与检测
•     4.3.3 转录组测序数据统计
•     4.3.4 基因功能注释
•     4.3.5 GO分类
•     4.3.6 KOG分类
•     4.3.7 基因表达水平分析
•     4.3.8 差异表达基因鉴定与分析
•     4.3.9 5d-HLVs13d-HL差异基因的GO富集
•     4.3.10 5d-HLVs13d-HL差异基因的KEGG富集
•     4.3.11 5d Vs13d差异基因的GO富集
•     4.3.12 5d Vs13d差异基因的KEGG富集
•     4.3.13 实时荧光定量PCR验证差异表达基因
•   4.4 小结与讨论
• 第五章 结论与展望
• 附录1 测序序列
• 附录2 主要符号缩略表
• 附录3 类胡萝卜素代谢途径分析图
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李振辉

导师: 陈由强

关键词: 杜氏盐藻,胡萝卜素,过表达,转录组

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.001192

总页数: 143

文件大小: 3786k

下载量: 11