新型葡萄糖氧化酶的基因克隆、表达和性质改良

论文摘要

葡萄糖氧化酶（GOX）已广泛应用。目前,除了曲霉和青霉属来源的GOX外,很少有新型GOX被报道。本研究采用平板显色的方法对实验室保存的真菌进行产GOX的筛选,耐寒枝孢菌Cladosporium neopsychrotolerans SL16表达了GOX活性。根据其基因组测序数据,克隆了GOX编码基因CngoxA。另外,根据GOX序列相似性,从枝孢菌C.tianshanense SL19和一株黑曲霉Aspergillus niger MJ5中克隆得到5个可能的GOX基因,分别为CngoxB、AngoxA5、AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3。CngoxA和CngoxB编码的蛋白与已报道验证功能的GOX最高一致性为35%,两者间一致性为80%,均为新颖的GOX。AngoxA5编码的蛋白与已验证功能的GOX最高一致性为97%,而AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3编码的蛋白与已报到GOX序列相似性约为50-68%。6个基因在毕赤酵母Pichia pastoris中进行表达,只有CngoxA和AngoxA5表达了具有葡萄糖氧化酶活性的蛋白。来源于C.neopsychrotolerans SL16的CnGOXA在20℃和pH 7.0的条件下具有最高活性,在0℃时依然具有75%的酶活力,属于低温酶,在40℃时的半衰期为15 min,在pH 6.0–9.0条件下稳定。CnGOXA比活力为90 U·mg-1,Km和Vmax分别是103 mM和90.1μmol·min-1·mg-1。CnGOXA对SDS具有较强抗性,5 mM和10 mM的SDS对其酶活力均无影响。重组的AnGOXA5的性质与A.niger来源的GOX（1CF3）性质相似。经过序列分析发现C.tianshanense SL19来源的CnGOXB C端较CnGOXA短,将CngoxA中对应的核酸序列拼接到CngoxB中获得了CngoxB-m1,并成功在毕赤酵母中表达,比活为123.8 U·mg-1,高于CnGOXA。为了提高CnGOXA的稳定性和催化活性,我们对CnGOXA进行了突变研究。在CnGOXA的Y169和A211位点引入二硫键（Y169C-A211C）,构建了突变体CnGOXA-M1。毕赤酵母中表达的CnGOXA-M1的最适pH与CnGOXA一致,而最适温度为25℃,较CnGOXA提高了5℃,其热稳定性和pH稳定性有了大幅提升,在40°C时的半衰期较野生型提高了48倍（720 min vs.15min）,pH稳定范围由pH 6.0–9.0扩大到pH 3.0–12.0,比活为123.8U·mg-1,较CnGOXA提高了37%。在CnGOXA-M1基础上,通过引入pi-pi键、氢键作用网络、盐桥以及表面电荷相互作用构建了T525H、G147R、E74K、E150K和E476K位点突变体,它们的热稳定性与CnGOXA-M1相比均提高。将5个位点组合获得了突变体CnGOXA-M2,相比于CnGOXA-M1,其在50℃处理1 h后剩余酶活力提高了约200倍（79.8%vs.0.4%）,比活为166.2 U·mg-1,提高了34%。面包烘焙实验结果表明CnGOXA-M1和A.niger来源GOX在面粉中的最佳添加量分别为6和4 U·kg-1,对应面包的体积与质量比分别为6.4和6.2 cm3·g-1,相比于未添加酶的空白对照组(5.9 cm3·g-1),均有效地促进了面包体积增加,而CnGOXA-M1效果更佳。本研究克隆了6个葡萄糖氧化酶基因,其中3个基因在毕赤酵母中成功进行表达并检测到了GOX活性。对CnGOXA进行了突变研究,有效提高了其热稳定性、pH稳定性和催化活性。CnGOXA-M1在面包烘焙实验中可有效促进面包体积增加。另外,CnGOXA-M1、M2在低温、中碱性条件下酶活力高以及抗SDS的特性使其在洗涤及水产饲料添加剂工业中具有应用潜力。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 葡萄糖氧化酶的结构及催化机理
•     1.1.1 葡萄糖氧化酶的结构
•     1.1.2 葡萄糖氧化酶的催化机理
•   1.2 葡萄糖氧化酶的来源、基因克隆与表达
•     1.2.1 来源
•     1.2.2 基因克隆与异源表达
•   1.3 葡萄糖氧化酶的理化性质
•   1.4 葡萄糖氧化酶的分子改良
•     1.4.1 葡萄糖氧化酶的固定化研究
•     1.4.2 葡萄糖氧化酶的定向进化和理性设计
•   1.5 葡萄糖氧化酶的应用前景
•     1.5.1 食品工业
•     1.5.2 医药和医疗业
•     1.5.3 饲料工业
•   1.6 问题与展望
•     1.6.1 目前的问题
•     1.6.2 展望与对策
•   1.7 研究内容与方法
•   1.8 研究目的与意义
• 第二章 葡萄糖氧化酶基因的克隆与表达
•   2.1 实验材料与仪器
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 引物合成
•     2.1.3 试剂盒、工具酶与生化试剂
•     2.1.4 培养基和溶液
•     2.1.5 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 产葡萄糖氧化酶菌株的筛选
•     2.2.2 葡萄糖氧化酶基因的克隆
•     2.2.3 葡萄糖氧化酶异源表达与性质测定
•   2.3 结果
•     2.3.1 产葡萄糖氧化酶菌株的筛选结果
•     2.3.2 葡萄糖氧化酶基因的克隆结果
•     2.3.3 葡萄糖氧化酶异源表达与性质测定结果
•   2.4 讨论
•   本章小结
• 第三章 枝孢菌来源葡萄糖氧化酶的分子改良
•   3.1 实验材料与仪器
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 引物合成
•     3.1.3 试剂盒、工具酶与生化试剂
•     3.1.4 培养基、溶液及面包制作材料
•     3.1.5 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 序列及结构分析
•     3.2.2 突变体表达质粒的构建
•     3.2.3 毕赤酵母GS115 感受态的制备与电击转化
•     3.2.4 葡萄糖氧化酶阳性转化子的筛选
•     3.2.5 葡萄糖氧化酶的摇瓶发酵和纯化
•     3.2.6 纯化的葡萄糖氧化酶的性质测定
•     3.2.7 基于MD分析CnGOXA和CnGOXA-M1结构
•     3.2.8 面包制作流程
•   3.3 结果
•     3.3.1 序列和结构分析结果
•     3.3.2 葡萄糖氧化酶阳性转化子的筛选结果
•     3.3.3 葡萄糖氧化酶的摇瓶发酵与纯化结果
•     3.3.4 葡萄糖氧化酶的部分酶学性质测定结果
•     3.3.5 CnGOXA-M1对面包的影响
•     3.3.6 CnGOXB突变体的部分酶学性质测定结果
•   3.4 讨论
•   本章小结
• 第四章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 葛建忠

导师: 罗会颖

关键词: 葡萄糖氧化酶,基因克隆表达,枝孢菌,分子改良,面包烘焙

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q78;Q55

总页数: 76

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