黍子过氧化物酶诱导结直肠癌细胞DNA损伤和坏死性凋亡

论文摘要

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤,近年来其发病率和死亡率在发展中国家不断增加。目前肿瘤治疗药物主要通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长,大多数癌细胞由于细胞凋亡机制失调而具有耐药性。Necroptosis是一种Caspase非依赖性细胞死亡方式,主要通过RIPK1和RIPK3严格调控,并且由MLKL执行完成。细胞受到内源性和外源性因素影响时,可诱导细胞发生DNA损伤（DSBs）,而DNA的DSBs是最严重的一种损伤。细胞发生DSBs后会激活细胞周期检查点,协调修复DNA损伤,调节基因表达。DSBs损伤分子标记物γH2AX在Necroptosis过程中会招募线粒体中的AIF易位形成DNA降解复合物,DNA DSBs的产生对染色质的溶解具有重要作用。Necroptosis为癌症治疗提供了新策略。本实验室已从黍糠中提取出一种含血红素辅基的阳离子过氧化物酶（proso millet peroxidase,PmPOD）,并且发现PmPOD可以诱导HCT116和HT29细胞发生RIPK1和RIPK3依赖性Necroptosis。虽然其确切的分子机制仍不清楚,但最近研究发现PmPOD可通过体外水解机制切割DNA，具有磷酸酶活性,暗示PmPOD可能会对细胞内DNA造成损伤。为了进一步分析PmPOD诱导HCT116和HT29细胞DNA损伤及其潜在作用机制。本课题以结直肠癌HCT116和HT29细胞为实验模型,以PmPOD为实验材料,对PmPOD诱导结直肠癌细胞Necroptosis诱因进行了深入研究。通过流式细胞术和ATP水平检测,结合特异性Necroptosis抑制剂Nec-1和凋亡抑制剂z-VAD-fmk,确定了 PmPOD诱导结直肠癌细胞Necroptosis;免疫荧光染色证明PmPOD类似于HRP,结直肠癌细胞通过胞饮作用摄入PmPOD;通过细胞周期检测、彗星电泳实验、免疫荧光染色和Western Blot等方法检测了 PmPOD作用结直肠癌细胞后,细胞DNA损伤情况;彗星电泳实验与坏死抑制剂、抗氧化剂结合,检测了 PmPOD诱导DNA损伤与Necroptosis、细胞内ROS水平升高之间的关系;最后通过siRNA p53和p53异位表达,研究了 PmPOD诱导DNA损伤和Necroptosis中p53的潜在作用机制。结果发现,PmPOD以剂量和时间依赖性方式诱导HCT116和HT29细胞Necroptosis，用特异性Necroptosis抑制剂Nec-1预处理HCT116和HT29细胞可阻止PmPOD诱导的细胞增殖抑制作用,而凋亡抑制剂z-VAD-fmk处理HCT116和HT29细胞没有作用。在结直肠癌细胞中PmPOD通过胞饮作用进入细胞,并且PmPOD进入细胞是诱导DNA损伤和Necroptosis必须的。PmPOD进入HCT116和HT29细胞后导致细胞周期停滞于S期,同时PmPOD诱导细胞DNA损伤和DSBs,以及γH2AX表达水平以时间依赖性和剂量依赖性方式显著增加。当细胞p53基因敲低后会显著加剧PmPOD诱导的DNA损伤,p53异位表达显著地降低了 PmPOD诱导的DNA损伤。这说明在结直肠癌细胞中,PmPOD依赖于p53的表达发挥其细胞毒性作用。这些结果都表明,在HCT116和HT29细胞中PmPOD诱导DSBs是Necroptosis的主要原因,肿瘤抑制蛋白p53可减轻PmPOD诱导Necroptosis通过p53介导的修复途径,促进细胞存活。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 结直肠癌简介
•   1.2 坏死性凋亡
•   1.3 DNA损伤应答
•     1.3.1 ATM-CHK2信号通路
•     1.3.2 ATR-CHK1信号通路
•   1.4 黍子过氧化物酶
•   1.5 研究目的及意义
• 第二章 PmPOD通过胞饮作用进入细胞
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料、试剂
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 细胞培养
•     2.3.2 细胞活力检测
•     2.3.3 细胞形态学观察
•     2.3.4 流式细胞术检测
•     2.3.5 免疫荧光染色
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 PmPOD对结直肠癌细胞形态的影响
•     2.4.2 PmPOD对结直肠癌细胞增殖的影响
•     2.4.3 PmPOD诱导HCT116和HT29细胞Necroptosis
•     2.4.4 PmPOD在结直肠癌细胞核中定位
•     2.4.5 细胞膜胆固醇降低抑制PmPOD诱导细胞增殖
•     2.4.6 细胞膜胆固醇降低对PmPOD定位的影响
•   2.5 讨论
• 第三章 PmPOD诱导细胞DNA损伤
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料、试剂与仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 细胞周期检测
•     3.3.2 单细胞凝胶电泳实验
•     3.3.3 细胞核形态观察
•     3.3.4 免疫荧光染色
•     3.3.5 Western Blot检测
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 PmPOD诱导HCT116和HT29细胞周期停滞于S期
•     3.4.2 PmPOD对细胞核形态的影响
•     3.4.3 PmPOD诱导结直肠癌细胞DSBs
•     3.4.4 PmPOD诱导DNA损伤发生在Necroprosis上游
•     3.4.5 PmPOD诱导结直肠癌细胞形成γH2AX
•     3.4.6 PmPOD诱导结直肠癌细胞γH2AX表达量上调
•     3.4.7 PmPOD诱导结直肠癌细胞形成p-ATM病灶
•     3.4.8 PmPOD诱导结肠癌细胞Lamin B1解聚
•   3.5 讨论
• 第四章 PmPOD诱导的DNA损伤和Necroptosis与p53表达有关
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料、试剂
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 单细胞凝胶电泳实验
•     4.3.2 MTT检测
•     4.3.3 siRNA p53干扰
•     4.3.4 pCMV3-TP53-myc质粒转染
•     4.3.5 Western Blot
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 siRNA p53对细胞活力的影响
•     4.4.2.siRNA p53对PmPOD诱导细胞DSBs的影响
•     4.4.3.p53异位表达对细胞活力的影响
•     4.4.4.p53异位表达对PmPOD诱导DSBs的影响
•   4.5 讨论
• 小结与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹忠琦

导师: 崔晓东

关键词: 阳离子过氧化物酶,坏死性凋亡,双链断裂,肿瘤抑制蛋白

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 山西大学

分类号: R73-3;Q55

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000019

总页数: 62

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