过氧化氢调控拟南芥抗病的下游基因的鉴定与功能分析

论文摘要

植物与病原微生物长期的相互作用下,其体内进化出复杂的防御机制。活性氧是植物体内应对外界胁迫因子（如干旱、病虫害等）的重要信号分子。其中光呼吸途径产生的过氧化氢（H2O2）是活性氧中具有最强稳定性以及较强活性的自由基,且介导水杨酸（SA）有关的植物免疫反应,H2O2在植物抗病反应中发挥着至关重要的作用,发掘和鉴定植物免疫反应中H2O2组分对于人们深入认识植物应对逆境的作用机制尤为关键。过氧化氢酶2（CAT2）是清除H2O2最关键的清除酶,拟南芥突变体（cat2）是研究H2O2作为信号调控SA介导的植物抗病,分析H2O2在SA抗病途径中信号转导机制的最佳材料。本研究利用甲基磺酸乙酯（EMS）对拟南芥cat2突变体进行化学诱变,从中筛选出cat2表型（叶片自发性细胞死亡）的抑制子,该抑制子与cat2互为父本母本进行回交,F2代分离比约为3:1,推测该细胞死亡抑制基因在核染色体上,且为隐性突变。生理生化初步检测该细胞死亡抑制子体内氧化水平较高,该基因突变没有影响H2O2的积累,可能作为信号位于H2O2的下游。细胞死亡抑制子回交的F2代进行混池测序,代表错误率的Q30数据显示样品质量良好,拟南芥基因组库的比对数据显示:亲本的平均深度为20和16;F2代平均深度为46和49;覆盖率均为98%以上。变异位点检测,并对候选区域计算,定位于第一条染色体。筛选候选点,统计变异位点在基因组的分布情况得到4个候选基因。候选基因和突变位点设计对应引物测序初步选定突变的基因为一种核孔蛋白:NUA。构建携带绿色荧光蛋白的NUA载体,阳性苗显示NUA蛋白定位于核膜。该基因的T-DNA插入突变体（nua-3）与cat2进行杂交筛选纯合突变材料,双突变体nua-3 cat2没有出现SA诱导的细胞死亡,初步判定该核孔蛋白参与光呼吸产生的H2O2介导SA诱导的植物抗病。因此,本研究拟综合采用遗传学、重基因组混池测序、分子生物学、细胞生物学等多种技术手段,以模式植物拟南芥为遗传材料,筛选出参与H2O2介导的SA相关途径诱导的叶片细胞死亡程序的一个关键成分,了解H2O2与SA相关的抗病信号网络,系统深入地研究H2O2在植物抗病中的调控机理,为提高农作物抗逆性提供理论依据。

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致谢

摘要

abstract

英文缩写符号及中英文对照表

第一章文献综述

1.1 植物与微生物互作

1.1.1 植物对病原菌微生物的抗病系统

1.1.2 SA在抗病中的作用

2O₂在植物抗病的作用'> 1.2 H₂O₂在植物抗病的作用

2O₂产生途径'> 1.2.1 H₂O₂产生途径

1.2.2 非酶促清除系统

1.2.3 酶促清除系统

2O₂的功能'> 1.2.4 H₂O₂的功能

1.3 植物核孔复合物

1.3.1 核孔复合物基本结构与组装

1.3.2 核孔复合物的功能

1.4 筛选和鉴定突变体

1.4.1 正向遗传学与反向遗传学

1.4.2 测序技术的发展及原理

1.4.3 全基因组重测序

1.5 本研究的目的与意义

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 种植方法和种植环境

2.1.3 实验所用主要设备和仪器

2.1.4 常用试剂配方

2.2 实验方法

2.2.1 EMS诱变拟南芥

2.2.2 拟南芥DNA的提取与PCR鉴定

2.2.3 谷胱甘肽含量测定

2.2.4 总SA的提取

2.2.5 RT-qPCR

2.2.6 混池测序

2.2.7 候选基因回补材料的构建

2.2.8 候选基因突变材料的构建

2.2.9 农杆菌侵染拟南芥

2.2.10 筛选阳性苗并用激光共聚焦检测信号

2.2.11 Pst.DC3000侵染拟南芥

第三章研究结果分析

3.1 筛选细胞死亡抑制突变体

3.2 细胞死亡抑制突变体的主根长和侧根

3.3 细胞死亡抑制突变体相关的混池测序

3.4 筛选细胞死亡抑制突变基因：NUA

3.5 构建NUA基因的CRISPR/CAS9敲除突变载体

3.6 NUA基因的GFP信号检测

3.7 PST.DC3000侵染NUA相关突变体

第四章讨论

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马铭悦

导师: 韩毅

关键词: 混池测序,抗病,核孔蛋白

来源: 合肥工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 合肥工业大学

分类号: Q943.2

总页数: 66

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