玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的条件优化

论文摘要

目的通过优化玻璃珠破碎法的条件,制备最具活性的重组人CYP2C9酵母微粒体,从而为建立更加灵敏快捷的体外代谢筛选模型提供依据。方法利用玻璃珠破碎的方法,制备重组人CYP2C9酵母微粒体。通过改变涡旋振荡次数和玻璃珠用量,优化制备微粒体的条件。用Lowry法测定微粒体中的蛋白含量,用CYP2C9的典型底物双氯芬酸与微粒体进行反应,以单位时间（h）内单位蛋白（mg/ml）所对应的双氯芬酸代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量来确定微粒体的蛋白活性。结果随着涡旋振荡次数和玻璃珠用量的增加,所制备微粒体蛋白的含量增加。当涡旋振荡次数为30次（每次涡旋振荡30 s,冷却60 s）,玻璃珠用量为0.75 g时,代谢物生成量和单位时间单位蛋白所对应代谢物生成量最大,分别为1.21μg和0.06μg/[（mg/ml）·h]。结论玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的最佳条件为涡旋振荡30次（每次涡旋振荡30 s,冷却60 s）和0.75 g玻璃珠。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 仪器与试剂
•     1.1.1 仪器
•     1.1.2 试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 玻璃珠预处理
•     1.2.2 未转染酵母菌和重组人CYP2C9酵母菌的培养
•       1.2.2.1 SD-His培养基 （g/L）
•       1.2.2. 2 YPD培养基 （g/L）
•       1.2.2. 3 未转染酵母菌培养流程
•       1.2.2. 4 重组人CYP2C9酵母培养流程
•     1.2.3 未转染酵母微粒体和重组人CYP2C9酵母微粒体的制备
•       1.2.3. 1 酵母微粒体缓冲液的制备
•       1.2.3. 2 未转染酵母微粒体的制备
•       1.2.3. 3 重组人CYP2C9酵母微粒体的制备
•     1.2.4 重组人CYP2C9酵母微粒体中蛋白含量的测定
•     1.2.5 重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的测定
•     1.2.6 HPLC色谱条件
• 2 结果
•   2.1 利用HPLC测定酵母微粒体反应体系中双氯芬酸及其代谢物的含量
•   2.2 涡旋振荡次数对重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的影响
•   2.3 玻璃珠用量对重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的影响
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 吴跃章,Zeinab Abdelrahaman,千文,池田胜也,杨长青

关键词: 重组人酵母,微粒体,玻璃珠,双氯芬酸

来源: 中国当代医药 2019年18期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,工程科技Ⅰ辑

专业: 有机化工,药学

单位: 中国药科大学基础医学与临床药学学院,南京珼瑞斯生物医药科技有限公司,日本藤川株式会社

基金: 江苏省",双创计划",(国外院士类)项目(苏人才办[2014]155号)

分类号: R943

页码: 8-12+18

总页数: 6

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