深海细菌Shewanella psychrophila WP2低温适应机制研究

论文摘要

深海普遍低温,栖居于此的微生物往往具有嗜冷的特性并进化出了相应的低温环境适应机制。Shewanella菌属是深海微生物中具有代表性的一类细菌,也是深海沉积物中的优势种群之一。因此,以Shewanella菌属为代表对深海细菌的低温适应性机制进行探究对理解深海微生物适应和演化具有重要价值。本论文以深海嗜冷细菌Shewanella psychrophila WP2为研究对象,以低温对其生长的影响为切入点,得到不同温度下培养过程中,不同生长时期WP2的胞内还原力、能量利用和物质代谢的规律,以及基因表达的差异,从而探究深海嗜冷细菌S.psychrophila WP2的低温适应性机制。WP2基因组比较分析发现其基因组为目前已测序Shewanella菌属中最大,拥有多达17个基因岛。通过潜在的水平基因转移,WP2获得了大量的辅助功能基因,可能增强了它的氮源利用能力,运动和趋化能力,以及应对复杂环境的群体感应能力和分泌抗生素功能,进而帮助其适应寡营养的复杂深海环境。通过对WP2细胞内ATP和还原力以及碳源利用情况的检测,同时构建WP2基因组规模代谢模型(Genome scale model),发现温度会影响深海嗜冷细菌S.psychrophila WP2的能量产生和物质利用,并促使WP2在低温条件下形成特殊的生理特征、能量利用和物质代谢模式。其中,模型预测结果还显示WP2与氨基酸代谢、核苷酸代谢和叶酸代谢相关的途径与温度适应性有密切关系。经实验证实,WP2在更接近原位环境的低温条件下可以累积到最大的生物量,说明WP2对深海冷环境的适应。转录组学分析显示在低温环境下WP2部分氨基酸,如:精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸和赖氨酸的合成增强,导致氨基酸组成比例发生变化,暗示WP2应对低温环境机制涉及细胞内氨基酸合成水平变化,推测有助于其在低温环境下的生存。同时,低温环境下WP2转录组结果还显示了加强的乙酰辅酶A合成及脂肪酸的合成,提高其对低温环境的适应。此外,在不同生长阶段下,WP2中还存在众多具有不同潜在功能的基因响应温度变化,并且差异表达基因的数目、种类和调节方式随细胞生长状态呈现动态变化。在这些差异表达基因中共发现26个基因,如:磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、苹果酸合成酶、核糖体替代拯救因子ArfA、OHCU脱羧酶、尿囊素酶等,在任何生长状态下都持续上调或下调表达,推测这些基因可能在WP2低温环境适应具有重要作用。综上所述,通过S.psychrophila WP2的全基因组代谢模型,发现与氨基酸代谢、核苷酸代谢和叶酸代谢相关的途径与温度适应性有密切关系。通过转录组分析,氨基酸合成、脂肪酸合成、乙酰CoA合成、葡糖异生、嘌呤代谢等功能在WP2的低温适应性方面发挥着重要的作用。本课题从细胞层面揭示S.psychrophila WP2的温度适应性,通过能量调控、物质利用和基因表达等方面“自上而下”地探究WP2对于低温环境的适应能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 深海环境及深海细菌研究概述
•     1.1.1 深海环境及研究概述
•     1.1.2 深海细菌概述
•   1.2 Shewanella菌属的研究概况
•     1.2.1 Shewanella菌属概况
•     1.2.2 Shewanella菌属内分类
•     1.2.3 Shewanella典型菌株研究概况
•   1.3 温度适应性的研究进展
•     1.3.1 膜结构
•     1.3.2 抗冻剂
•     1.3.3 酶
•     1.3.4 分子伴侣
•     1.3.5 代谢调节
•   1.4 本论文的研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 本研究中用到的菌株和质粒
•     2.1.2 本研究中用到的引物
•     2.1.3 主要实验试剂
•     2.1.4 培养基和试剂配方
•     2.1.5 主要仪器设备
•     2.1.6 工具软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 S.psychrophila WP2 培养及生长曲线测定
•     2.2.2 ATP含量的测定
• +和NADH的含量测定'>    2.2.3 NAD⁺和NADH的含量测定
•     2.2.4 HPLC-QQQ MS测定培养基中剩余碳源
•     2.2.5 细菌总RNA的提取
•     2.2.6 转录组测序以及数据分析
•     2.2.7 实时荧光定量PCR分析
•     2.2.8 基因敲除载体及WP2 突变菌株的构建
•     2.2.9 细菌总DNA的提取
•     2.2.10 PCR扩增反应
•     2.2.11 琼脂糖凝胶电泳和胶回收
•     2.2.12 质粒提取
•     2.2.13 WM3064 感受态细胞的制备
•     2.2.14 E.coli的热激转化
•     2.2.15 功能基因的预测和注释
•     2.2.16 系统发育树的构建
•     2.2.17 基因组岛的预测
• 第三章 S.PSYCHROPHILA WP2 基因组学分析
•   3.1 前言
•   3.2 WP2 的系统发育地位
•   3.3 基因功能分类及比较
•   3.4 代谢潜能分析
•   3.5 基因组岛分析
•   3.6 小结与展望
• 第四章 S.PSYCHROPHILA WP2 在不同温度下的生理差异
•   4.1 前言
•   4.2 WP2 的生长曲线
•   4.3 WP2 在不同温度下不同生长阶段能量及还原力检测
•   4.4 WP2 在不同温度下不同生长阶段碳源利用情况
•   4.5 WP2 的基因组规模代谢网络模型
•   4.6 小结与展望
• 第五章 S.PSYCHROPHILA WP2 的转录组学分析
•   5.1 前言
•   5.2 WP2 转录组数据概况
•   5.3 不同生长阶段下的转录组分析
•     5.3.1 氨基酸的合成
•     5.3.2 乙酰CoA的合成与脂肪酸的合成
•     5.3.3 其他潜在的与低温适应性相关的基因
•   5.4 持续上/下调响应低温的差异表达基因
•   5.5 小结与展望
• 第六章 总结与展望
•   6.1 主要工作与创新点
•   6.2 工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 聂唱

导师: 王风平

关键词: 希瓦氏菌,温度适应性,转录组学

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q935

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002735

总页数: 80

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