H3K27me3在SOX2重编程内皮细胞中的作用机制

论文摘要

背景:内皮祖细胞对血管生成缺乏,内皮功能障碍等相关的心血管病理变化和血管疾病的治疗有重大意义。然而内皮祖细胞来源有限,重编程内皮细胞是获得内皮祖细胞的有效方法。四种重编程因子OCT4,SOX2,KLF4和c-MYC能够对细胞进行“重编程”,使细胞突破表观遗传屏障,获得多能性。H3K4me3和H3K27me3分别可以促进和抑制基因的转录,而二者构成的二价修饰则将基因的表达维持在一个较低水平的平衡状态。目的:探索SOX2在内皮细胞重编程中的作用,和其中组蛋白甲基化机制。方法:本研究以人脐静脉内皮细胞为研究对象,在过表达SOX2组,空载体组以及人脐静脉内皮细胞中,通过RT-q PCR、western blot的方法分别在基因表达和蛋白水平上确定内皮祖细胞分子标志物CD133、CD34、VEGFR2和v WF的表达;透射电镜观察细胞超微结构的变化;观察低密度乙酰脂蛋白摄取水平;Ed U和克隆形成实验确定细胞的增殖能力;通过Matrigel基质胶体外成管实验确定对成管能力的影响;pc DNA3.0-SOX2和pc DNA3.0对比,利用RNA-seq检测差异表达基因,并进行聚类分析以及富集和功能注释分析;通过western blot和免疫荧光的方法,检测H3K27me3和H3K4me3表达;通过RT-q PCR和western blot检测H3K27me3修饰酶EZH2的变化;最后通过生物信息学的方法预测SOX2在EZH2启动子区结合位点。结果:过表达SOX2后,RT-q PCR结果表明内皮祖细胞分子标志物CD133,CD34,v WF,VEGFR2表达上调,western blot结果显示CD133,CD34,v WF的蛋白表达上调,VEGFR2表达下降;透射电镜下观察到细胞常染色质增多、异染色质减少,核仁变疏松、部分核仁呈海绵状、核仁数量增加,线粒体嵴变粗、线粒体膜变厚以及吞噬泡增加的现象;低密度乙酰脂蛋白摄取实验显示对低密度乙酰脂蛋白摄取能力下降;Matrigel血管形成实验显示成血管能力降低;Ed U和克隆形成实验表明增殖能力无影响;聚类分析显示了106个差异表达基因表达变化,以及表达模式相似的基因功能相关性,后续功能富集分析显示差异表达基因参与多细胞生物发育的调节、细胞发育的调节、发育过程的调节、调节细胞分化等生物进程以及调节干细胞的多能性等信号通路,功能注释分析显示差异表达基因与发育过程、细胞器、膜以及染色质结构和动力学、翻译,核糖体结构和生物发生、转录等功能相关;组蛋白修饰H3K27me3和H3K4me3的western blot以及免疫荧光结果显示,过表达SOX2后,H3K4me3表达量不变,H3K27me3的表达下调,提示H3K27me3表达的改变可能影响了SOX2对内皮细胞去分化的调控作用;RT-q PCR和western blot结果显示H3K27me3甲基化酶EZH2在基因表达和蛋白水平上下调;最后生物信息学预测SOX2在EZH2的启动子区有5个结合位点。结论:在人脐静脉内皮细胞中,SOX2通过下调组蛋白甲基化酶EZH2下调H3K27me3,并且可能是通过直接结合EZH2启动子区发挥转录调控作用的;同时SOX2的过表达激活了内皮祖细胞标志物CD133等基因的转录,并且低密度乙酰脂蛋白摄取能力和成管能力降低,这表明可能产生去分化,获得内皮祖细胞或产生内皮祖细胞特征细胞。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 文献综述
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料和仪器
•     2.1.1 材料来源
•     2.1.2 主要仪器及耗材
•     2.1.3 主要试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 HUVEC细胞培养
•     2.2.2 脂质体转染法构建高表达SOX2 及空载组的HUVEC
•     2.2.3 透射电镜法
•     2.2.4 EDU法
•     2.2.5 Matrigel成管实验
•     2.2.6 acLDL摄取实验
•     2.2.7 RNA提取
•     2.2.8 RT-qPCR
•     2.2.9 蛋白提取以及western blot分析
•     2.2.10 RNA-seq与生物信息学分析
•     2.2.11 生物信息学预测启动子结合位点
•     2.2.12 统计学分析
• 第3章 实验结果
•   3.1 EPCs标志物表达上调且分子功能改变
•     3.1.1 多能性标志物无变化
•     3.1.2 EPCs分子标志物上调
•     3.1.3 细胞结构和功能检测
•   3.2 差异表达基因的生物信息学分析
•     3.2.1 差异表达基因的聚类分析
•     3.2.2 差异表达基因功能富集分析
•     3.2.3 差异表达基因功能注释分析
•   3.3 组蛋白修饰及相关修饰酶检测
•     3.3.1 组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3 的表达
•     3.3.2 组蛋白修饰酶EZH2 的表达
•   3.4 SOX2与EZH2 启动子区直接结合情况
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 作者简介及攻读硕士期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李绘宇

导师: 李莉莎

关键词: 人脐静脉内皮细胞,重编程

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R329.2

总页数: 56

文件大小: 2988K

下载量: 34