果蝇Kc细胞对溴氰菊酯应激响应的机理研究

论文摘要

溴氰菊酯（DM）被广泛应用于农业、公共卫生和兽医学等领域,由于使用量大、范围广,导致了全球性的抗药性,因此,深入研究DM的抗性机理具有非常重要的意义。有研究报道DM能引起昆虫细胞氧化应激,而Nrf2-Keap1信号通路是细胞中重要的抗氧化通路,在预防外源性物质损伤方面发挥着关键作用。Nrf2基因通过调节多种抗氧化和解毒酶的表达来调控抗氧化反应和异生质代谢,从而保护细胞免受包括内源性物质、活性氧（ROS）、辐射和环境毒素在内的刺激导致的损伤。因此我们推断转录因子Nrf2可能在DM应激和耐受中发挥作用。为探究Nrf2通路与昆虫DM耐受性之间的关系,我们以果蝇Kc细胞为模式细胞,分析Nrf2对DM的应激响应及细胞DM耐受水平的影响,结果如下:1、DM刺激后细胞内ROS含量迅速增加。应激细胞中ROS的生成量与DM剂量和应激时间相关,在一定DM剂量内ROS量随着剂量增加不断增加并达到峰值;在同一剂量下,ROS量随着应激时间增加不断增加并达到峰值。2、DM刺激可以使细胞中Nrf2基因的表达显著上调并发生核聚集。qPCR检测显示,20 ppm DM诱导24 h时,细胞中Nrf2基因的转录水平达到最大,WB检测显示,20 ppm DM诱导36 h时,细胞中Nrf2蛋白的核聚集作用最为明显。3、流式细胞分析结果表明,在DM刺激下,Nrf2基因过表达（N+）处理组的存活率明显高于对照组和Keap1基因过表达（K+）、Nrf2基因干扰（N-）处理组;K+处理组的存活率低于N+处理组,但是高于N-处理组。4、根据Nrf2诱导解毒酶和抗氧化酶的能力,实验选取了四个I相解毒酶基因——细胞色素P450-3A4（CYP 3A4）、细胞色素P450-6a8（CYP 6a8）、乙醛脱氢酶（ALDH）、乙醇脱氢酶（ADH）,四个II相解毒酶基因——谷胱甘肽S转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）,采用qPCR技术对各处理组中这些酶基因的表达量进行了定量分析。检测数据显示,虽然选取的几种酶大多数都受Nrf2的正向调控,但是受影响程度不同。上述研究结果表明:DM的刺激可以激活细胞中的Nrf2基因,表现为Nrf2mRNA含量的上升、细胞核内Nrf2蛋白的增加以及解毒酶基因表达量增加。这些结果表明转录因子Nrf2通过Nrf2-Keap1通路调节代谢相关基因的表达,在溴氰菊酯耐受和抗性发展中发挥作用。因此可以认为,Nrf2是氧化应激的潜在治疗靶点和耐药控制的潜在分子靶标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 昆虫抗药性现状及研究进展
•     1.1.1 农药发展及危害分析
•     1.1.2 全球昆虫抗药性现状
•     1.1.3 当前的害虫防治策略
•   1.2 氧化应激及Nrf2 信号通路
•     1.2.1 氧化应激简述
•     1.2.2 Nrf2 信号通路
•   1.3 细胞凋亡检测技术及其应用
•   1.4 昆虫耐药性相关解毒酶的研究进展
•   1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 果蝇Kc细胞对DM胁迫的应激响应
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 果蝇Kc细胞
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验操作
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 DM诱导果蝇Kc细胞
•     2.2.3 氧化应激水平检测
•     2.2.4 总RNA的提取
•     2.2.5 RNA浓度检测及c DNA的合成
•     2.2.6 荧光定量PCR
•     2.2.7 核质蛋白的分离提取
•     2.2.8 蛋白免疫印迹分析
•     2.2.9 细胞活性检测
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 DM能有效的引起细胞中的氧化应激反应
•     2.3.2 DM胁迫对Nrf2 基因的诱导作用
•     2.3.3 DM胁迫对细胞活性的影响
•   2.4 小结与讨论
•     2.4.1 细胞中有害物质的清除与氧化应激相关通路有关
•     2.4.2 Nrf2 基因参与了DM引起的氧化应激相关过程
•     2.4.3 Nrf2 基因的活化有助于细胞在DM刺激下存活
• 第三章 Nrf2 表达量变化对果蝇Kc细胞耐受DM能力的影响
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验操作
•     3.2.1 DM刺激果蝇Kc细胞
•     3.2.2 氧化应激水平检测
•     3.2.3 细胞活性检测
•     3.2.4 蛋白免疫印迹分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 细胞中Nrf2 蛋白的核质分布情况
•     3.3.2 Nrf2 表达量的改变对细胞中氧化应激水平的影响
•     3.3.3 Nrf2 表达量的改变对细胞活性的影响
•   3.4 小结与讨论
•     3.4.1 Nrf2 的表达水平与细胞对DM耐受能力相关
• 第四章 Nrf2 下游基因表达量与DM应激相关性分析
•   4.1 实验材料
•   4.2 实验操作
•     4.2.1 DM刺激果蝇Kc细胞
•     4.2.2 荧光定量PCR
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 DM胁迫对解毒酶基因的调控作用
•     4.3.2 Nrf2 表达量对下游解毒酶基因的调控作用
•     4.3.3 凋亡相关基因relish的检测
•   4.4 小结与讨论
•     4.4.1 在DM的刺激下Nrf2 下游相关解毒酶基因的表达量升高
•     4.4.2 凋亡相关基因检测结果与细胞凋亡检测结果一致
• 全文总结
• 参考文献
• 在读学位期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈露

导师: 程罗根

关键词: 转录因子,溴氰菊酯,氧化应激,耐药性

来源: 南京师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京师范大学

基金: 国家自然科学基金项目(31460482)

分类号: Q965

DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001037

总页数: 52

文件大小: 2999K

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