PPRV感染山羊PBMCs后TWEAK表达对NK细胞功能的影响研究

论文摘要

小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus,PPRV）是世界范围内严重影响羊等小反刍动物产业发展的重要病原体。PPRV具有较强的淋巴细胞噬性,其感染机体后主要引起宿主天然免疫及特异性免疫抑制。自然杀伤细胞（Nature killer cells,NK cells）是天然免疫系统中重要的免疫细胞,在清除早期感染病毒中发挥关键作用。肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子（Tumor necrosis factor-related weak inducer of apoptosis,TWEAK）是表达于包括NK细胞、树突细胞在内的多种免疫淋巴细胞中的分泌性蛋白质分子,在天然免疫反应中具有关键调控作用。目前,关于PPRV感染山羊后体内NK细胞的抗病毒免疫反应调控机制尚不清楚。本试验通过研究PPRV感染对山羊NK细胞毒性和分泌表达的调节作用,以及TWEAK通路在该作用中的分子调节机制,旨在探明PPRV感染对山羊NK细胞表型及免疫功能的影响及其作用机制。获得的研究结果如下:1.将PPRV N75-1疫苗株体外感染山羊外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,检测感染后不同时间PBMCs中NK细胞数量和分泌表达功能及其对病毒复制水平的影响。流式细胞术检测结果发现,CD16+/CD14-NK细胞数量在感染后24 h显著增加,NK细胞的溶细胞活性和炎性细胞因子分泌水平显著降低。TCID50和Western blot检测结果发现,感染后24 h病毒复制水平显著增加,感染后72 h病毒滴度较24 h显著增加;Western blot检测结果发现,PBMCs感染PPRV 24 h后TWEAK蛋白表达水平显著增加。2.将TWEAK过表达慢病毒、si-TWEAK及相应的对照转染至山羊PBMCs,检测PPRV感染后TWEAK表达水平对NK细胞功能活性及其对病毒复制的调控作用。Western blot检测结果发现,过表达TWEAK引起NK细胞功能活性降低,抑制TWEAK表达引起NK细胞功能活性增加。TCID50和Western blot结果发现,过表达TWEAK促进了PPRV在山羊NK细胞中的复制,敲降TWEAK表达能抑制PPRV复制水平。3.基于靶标预测软件及双荧光素酶报告基因试验对PPRV感染PBMCs中差异表达miRNAs进行靶基因预测,结果发现,山羊PBMCs源miR-1直接靶向TWEAK mRNA的3’UTR,并以PPRV感染时间依赖性和感染剂量依赖性负向调控TWEAK mRNA及蛋白质表达水平。在PBMCs中分别转染miR-1模拟物/抑制剂及加入重组TWEAK,进一步证实miR-1通过负向调控TWEAK表达水平增强NK细胞的功能活性,进而抑制PPRV复制水平。4.将PPRV及紫外线灭活PPRV感染PBMCs,研究病毒复制能力是否在miR-1介导的TWEAK表达中发挥作用。结果表明,病毒复制对miR-1的表达至关重要。将携带PPRV-N、-H和-V基因的质粒分别转染至PBMCs,48 h后感染PPRV,研究PPRV病毒蛋白对miR-1以及TWEAK表达水平的影响。结果发现,PPRV-V蛋白通过下调miR-1的表达,导致TWEAK mRNA和蛋白水平表达上调。5.将TWEAK过表达慢病毒或si-TWEAK及相应对照转染至PBMCs,48 h后感染PPRV,研究PPRV感染后TWEAK通路相关蛋白表达变化。结果表明,miR-1直接靶向负调控TWEAK,上调SOCS1,抑制STAT3的磷酸化和激活MyD88/NF-κB p65信号通路,从而对NK细胞功能活性进行调控。综上所述,山羊外周血NK细胞感染PPRV后,miR-1通过靶向TWEAK信号通路负向调控NK细胞的功能活性。最终,揭示了PPRV感染过程中,TWEAK在山羊外周NK细胞毒性和细胞因子分泌表达中的分子调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
•   第一章 PPRV感染与NK细胞抗病毒免疫及TWEAK调控机制研究进展
•     1.1 PPRV与宿主免疫应答研究进展
•       1.1.1 PPRV概述
•       1.1.2 PPRV与免疫应答
•     1.2 NK细胞抗病毒天然免疫研究进展
•       1.2.1 NK细胞概述
•       1.2.2 NK细胞的抗病毒机制
•     1.3 TWEAK及相关miRNA研究进展
•       1.3.1 TWEAK概述
•       1.3.2 TWEAK及相关miRNA
•     1.4 本研究的目的意义
• 试验研究
•   第二章 山羊PBMCs感染PPRV后 TWEAK表达对NK细胞表型和功能的影响
•     2.1 材料
•       2.1.1 毒株
•       2.1.2 主要试剂
•       2.1.3 主要仪器
•     2.2 方法
•       2.2.1 细胞的分离与培养
•       2.2.2 病毒感染细胞
•       2.2.3 PPRV病毒滴度测定
•       2.2.4 流式细胞术分析PPRV感染对NK细胞表型和功能的影响
•       2.2.5 Western blot检测
•       2.2.6 脂质体型转染小干扰RNA（siRNA-TWEAK）
•       2.2.7 慢病毒转导TWEAK
•       2.2.8 统计分析
•     2.3 结果
•       2.3.1 PPRV感染对山羊外周血NK细胞数量的影响
•       2.3.2 PPRV感染对山羊外周血NK细胞功能活性的影响
•       2.3.3 山羊PBMCs感染PPRV后 TWEAK表达对NK细胞功能活性的作用
•       2.3.4 TWEAK对 PPRV复制的调节作用
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 miR-1对TWEAK的转录后调控及其对NK细胞功能的影响
•     3.1 材料
•       3.1.1 主要试剂
•       3.1.2 主要仪器
•     3.2 方法
•       3.2.1 差异表达miRNA的潜在靶基因预测及双荧光素酶报告基因分析
•       3.2.2 荧光定量PCR检测miR-1 表达水平及TWEAK mRNA表达水平
•       3.2.3 紫外灭活PPRV对 miR-1及TWEAK表达的影响
•       3.2.4 转染miR-1 mimic/inhibitor研究miR-1通过介导TWEAK信号通路对NK细胞功能进行调控
•       3.2.5 统计分析
•     3.3 结果
•       3.3.1 miR-1 直接靶向负调控TWEAK表达
•       3.3.2 PPRV复制影响miR-1 介导的TWEAK表达水平
•       3.3.3 miR-1 调控PPRV感染山羊PBMCs中 TWEAK表达水平及病毒复制水平
•       3.3.4 miR-1 抑制PPRV感染的山羊外周血NK细胞溶细胞效应分子和细胞因子的表达
•       3.3.5 miR-1 通过TWEAK信号通路调控NK细胞功能
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   结论
• 主要符号对照表
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李珍

导师: 王晶钰,齐雪峰

关键词: 细胞,山羊

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金(编号:31572588)

分类号: S852.65

总页数: 55

文件大小: 1961K

下载量: 56