围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析

论文摘要

设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础。利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA。添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性。构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化。RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达。成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组（P<0.05）。成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30%。诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低（P<0.01）;与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低（P<0.01）,阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异。3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组。体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 sgRNA的设计与合成
•     1.2.2 Cas9/gRNA表达载体的构建及鉴定
•     1.2.3 sgRNA序列的体外切割活性验证
•       1.2.3. 1 PCR体外扩增转录模板
•       1.2.3.2 sgRNA体外转录
•       1.2.3. 3 Cas9体外酶切
•     1.2.4 CRISPR/Cas9质粒载体细胞内活性鉴定
•       1.2.4. 1 T3-L1细胞的培养
•       1.2.4.2电转染
•       1.2.4. 3 嘌呤霉素筛选
•       1.2.4. 4 诱导分化
•       1.2.4.5实时荧光定量PCR检测细胞中PLIN1 mRNA的表达
•       1.2.4. 6 Western blot检测细胞中PLIN1蛋白的表达量
•       1.2.5 PLIN1基因敲除对3T3-L1细胞脂解的影响
• 2 结果
•   2.1 CRISPR/Cas9质粒干扰载体构建及鉴定
•   2.2 sgRNA体外切割活性鉴定
•   2.3 3T3-L1前脂肪的诱导分化
•   2.4 3T3-L1脂肪细胞中PLIN1 mRNA的表达
•   2.5 3T3-L1脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达
•   2.6 PLIN1基因敲除对脂解的影响
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 许祥,董维鹏,张少华,冯晨毅,刘田福,燕炯

关键词: 基因,载体构建,切割效率

来源: 生物技术通报 2019年11期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学

单位: 山西医科大学公共卫生学院,山西医科大学动物实验中心

基金: 山西省国际科技合作项目（2014081050-1）,山西省实验动物资源共享服务平台,山西医科大学科技创新基金项目（01201504）

分类号: Q78

DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0357

页码: 89-95

总页数: 7

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