假别单胞菌论文_褚艳

导读:本文包含了假别单胞菌论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:胞菌,基因,论文,假别单,琼胶寡糖,琼胶酶。

假别单胞菌论文文献综述

褚艳^[1]（2003）在《海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质研究》一文中研究指出随着糖生物学和化学研究的发展，近几年来人们发现不同聚合度的琼胶寡糖具有重要的药用价值，如抗肿瘤、抗感染、抗氧化等，有望发展为新一代海洋药物和功能食品，具有强大的市场竞争力和广阔的发展前景。传统的琼胶寡糖制备方法是琼胶的化学稀酸水解法，该方法的裂解产物分子量不均一，难以得到足量的低聚糖纯品。而琼胶酶降解底物的专一性强，有利于单一低聚糖的制备。然而目前已发现的琼胶酶不但活性低，而且产物特异性较差，成为制约琼胶寡糖构效关系和应用研究的瓶颈因素。因此，高活性、高特异性的琼胶酶的发现具有重要理论意义和广阔应用前景。本论文利用琼胶作为唯一碳源的选择性培养法从海水中分离得到1株高产琼胶酶的菌株，通过形态观察、生理生化实验以及16SrRNA序列分析，鉴定该菌株属于假别单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24。经发酵条件优化确定最适培养基配方为(w/v)：NaCl 2.5％、干酪素0.25％、MgSO_4·7H_2O 0.5％、KCl 0.1％、FeSO_4·7H_2O 0.002％、CaCl_2 0.02％、NaH_2PO_4 0.06％、琼胶0.25％、pH7.0。最佳培养条件为25℃培养24h，优化后粗酶液的酶活最高可达1.8U/ml，较优化前提高了20倍。利用鸟枪法从Pseudoalteromonas sp.CY24中克隆到1个琼胶酶基因(agaA)。首先提取Pseudoalteromonas sp. CY24的基因组DNA，分别利用PstⅠ和HindⅢ进行条件性酶切，回收2.5-7.0 kb的DNA片断，重组于pBlueseriptⅡKS(+)载体转化Escherichia coli DH5α，建立基因组文库。利用琼胶唯一碳源培养基结合蓝白斑筛选得到9株具有琼胶酶活性的阳性重组子，对其中1株的重组质粒pA5进行测序，测序结果表明，pA5中插入了包含琼胶酶基因在内的共3.5kb的外源片断。根据生物信息学分析和亚克隆的建立，确定了琼胶酶基因的开放阅读框架为1359bp。用DNATools分析软件得到的该琼胶酶的一级结构共含氨基酸453个，分子量为50.8kDa，pⅠ值为6.07。agaA基因的序列分析表明：在起始密码子上游具有SD序列及启动子序列中较为保守的-10区和-35区，在翻译的终止密码子下游25个碱基处出现9个碱基的反向重复序列，形成发夹结构的自有能为-12.9kcal，具有典型的不依赖于p因子的终止子的序列特征。用SignalP在线分析软件对agaA翻译产物N端的前50个氨基酸进行信号肽预测，发现前23个氨基酸具有信号肽的特征，蛋白质合成后，通过在23位和24位氨基酸之间进行切割而形成最终的成熟蛋白。用CLASTALW系统对该琼胶酶与其它已知琼胶酶进行氨基酸序列同海洋假别单胞菌cY24的琼胶酶基因的克修、重组表达及酶学性质研究源性分析，并未发现有显着相似性的序列(序列一致性不大于40%，序列相似性不大于75%)，证明本文克隆的雌喇是一种新的琼胶酶基因。该序列已提交GenBank，登录号为AYI 50179。利用pET一24a(+)质粒构建了日gaA基因表达载体，在表达产物c末端融合了6个组氨酸的标签(6 X His·Tag)。利用化学转化法将构建的琼胶酶表达载体转入E.coli BL21(DE3)表达宿主中，筛选阳性克隆扩大培养，通过IPTG诱导，菌体中出现了大量诱导表达的重组蛋白，超声波破碎上清液有明显的琼胶酶活性。经镍离子柱分离纯化后，SDS一PAGE检测为单一条带，说明已达到电泳纯。重组琼胶酶的理化性质与根据氨基酸序列的理论推测值基本一致。重组琼胶酶的基本酶学研究表明，酶的最适pH为6.5，pH稳定范围较大(4一10);最适温度为40℃，在40℃以上时酶活力迅速衰减;最适底物琼脂糖浓度为0.25%。利用TLC法(Thin Layer chromat。孚aphy)对酶与底物的作用方式进一行研究，结果表明琼胶酶特一性地降解琼脂糖的半乳糖交联结构中的p(l一4)糖昔键，属p一琼胶酶。利用队eE(Fluorophore一assistede砒。场drate electroPhoresis)技术对酶解琼脂糖得到的低聚糖组分进行分析，发现酶解的最终产物主要为新琼四糖和新琼六糖，并且四糖和六糖的含量大于90%。综上所述，本论文利用现代分子生物学的最新技术，从海洋假别单胞菌CY24中克隆并重组表达了一种新的琼胶酶基因，酶学性质研究表明该酶具有高活力和高底物专一性，为高纯度琼胶寡糖的大量制备创造了条件，为琼胶寡糖的基础和应用研究提供技术支撑，满足人类日益增长的需求。为海洋寡糖类创新药物的研究开发以及相关产业的发展奠定新的技术方法学基础，对推动糖生物学和化学研究的深入开展具有重要意义。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2003-06-10）