截短的NDV F、IBV S1二联重组干酪乳杆菌的构建及其免疫原性分析

论文摘要

为获得NDV F和IBV S1重组蛋白,建立间接ELISA方法。根据NDV F和IBV S1的基因序列,设计合成特异性引物,分别构建表达NDV F蛋白和IBV S1蛋白的原核表达体系,Western blot验证结果表明重组蛋白具备良好的反应活性,可用于后续试验。为构建重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei,获得表达产物,探讨其免疫效果。本实验将NDV F及IBV S1部分抗原表位区段串联后与穿梭质粒PLA连接,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组质粒,电转化至干酪乳杆菌中,构建重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei,应用PCR鉴定阳性菌株,SDS-PAGE检测重组蛋白,获得大小约78 kDa的重组蛋白,与预期结果一致,Western blot结果显示重组蛋白可与抗NDV、IBV全病毒血清结合,具有良好的反应活性,通过间接免疫荧光筛选阳性表达菌,并对其进行流式细胞术检测,随机筛选的10 000个重组菌中阳性率达96.05%,激光共聚焦检测表明蛋白成功展示于重组菌表面。试验选用14日龄雏鸡,各组免疫方式为口服+滴鼻。分别设立pLA-F-S1/L.casei两次免疫组和三次组、pLA-F/L.casei组、pLA-S1/L.casei组、商品疫苗组、pLA/L.casei组和PBS组。间接ELISA方法检测雏鸡血清IgG、肠道、鼻腔、肺脏中sIgA抗体效价,评价试验组雏鸡攻毒保护率。结果表明各免疫组IgG和sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）,pLA-F-S1/L.casei三次免疫组与两次免疫组相比,抗体滴度没有显著增长,抗体持续时间最多可有效延长至三免后第28 d。pLA-F-S1/L.casei组抗体水平与pLA-F/L.casei组和pLA-S1/L.casei组没有显著差异。末免7 d后进行攻毒试验,pLA-F-S1/L.casei组试验鸡对NDV F48E8株和IBV M41株的保护率分别为80%和90%,淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫重组菌后细胞免疫水平显著增长,显著高于pLA/L.casei组（0.05<p<0.01）和PBS组（0.01<p<0.001）,因此,综合以上结果,重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei可诱导机体黏膜免疫应答、细胞免疫及体液免疫,可有效预防NDV、IBV的感染,相对于分别免疫pLA-F/L.casei和pLA-S1/L.casei,其更具经济效益,为针对该病的多价重组乳酸菌口服疫苗的研制提供重要的研究基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 1 文献综述
•   1.1 新城疫研究进展
•     1.1.1 病原学
•     1.1.2 NDV主要免疫原性蛋白研究
•     1.1.3 新城疫基因工程疫苗的研究进展
•   1.2 鸡传染性支气管炎研究进展
•     1.2.1 病原学
•     1.2.2 IBV主要免疫原性蛋白研究
•     1.2.3 鸡传染性支气管炎基因工程疫苗的研究进展
•   1.3 干酪乳杆菌作为抗原呈递载体的研究进展
•     1.3.1 干酪乳杆菌的耐受能力
•     1.3.2 干酪乳杆菌诱发的机体免疫
•     1.3.3 干酪乳杆菌作为表达载体的应用
•   1.4 本研究的目的和意义
• 2 部分NDV F、IBV S1 原核表达载体构建及蛋白纯化
•   2.1 材料
•     2.1.1 病毒、质粒、菌株、商品疫苗
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•   2.2 方法
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 NDV LaSota病毒、IBV H120 病毒液增殖
•     2.2.3 NDV LaSota病毒、IBV H120 病毒RNA的提取
•     2.2.4 RT-PCR扩增目的基因
•     2.2.5 重组质粒pMD18-T-F、pMD18-T-S1 的构建与鉴定
•     2.2.6 重组原核表达载体构建与鉴定
•     2.2.7 目的基因于大肠杆菌的蛋白表达
•     2.2.8 重组蛋白的纯化
•     2.2.9 抗血清的制备
•     2.2.10 重组蛋白的Western blotting鉴定
•   2.3 结果
•     2.3.1 目的基因的扩增结果
•     2.3.2 重组质粒pMD18-T-F、pMD18-T-S1 鉴定
•     2.3.3 重组质粒pET-32a-F、pET-32a-S1 鉴定
•     2.3.4 目的蛋白最佳诱导条件的确定
•     2.3.5 蛋白可溶性鉴定
•     2.3.6 Western blotting鉴定结果
•   2.4 讨论
• 3 串联表达NDV F、IBV S1 二联重组干酪乳杆菌的构建
•   3.1 材料
•     3.1.1 菌株、质粒
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 重组质粒pLA-F的构建与鉴定
•     3.2.2 重组质粒pLA-F-S1 的构建与鉴定
•     3.2.3 重组干酪乳杆菌pLA-F-S1/L.casei的构建
•   3.3 结果
•     3.3.1 IBV S1 基因的鉴定结果
•     3.3.2 重组质粒pLA-F-S1 鉴定结果
•     3.3.3 pLA-F-S1/L.casei鉴定结果
•   3.4 讨论
• 4 pLA-F-S1/L.casei的免疫原性分析
•   4.1 材料
•     4.1.1 菌株、毒株、实验动物
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 免疫用重组干酪乳杆菌菌悬液的制备
•     4.2.2 试验动物分组
•     4.2.3 样品的采集
•     4.2.4 免疫效果评价
•     4.2.5 攻毒保护性试验
•   4.3 结果
•     4.3.1 血清中抗NDV、IBV特异性IgG检测
•     4.3.2 肠道、肺脏、鼻腔洗液中sIgA效价检测
•     4.3.3 脾脏T淋巴细胞增殖检测结果
•     4.3.4 攻毒保护性试验结果
•   4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘欢欢

导师: 侯喜林

关键词: 蛋白,重组干酪乳杆菌,黏膜免疫,抗原性

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

分类号: S852.4

总页数: 90

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