论文摘要
细胞是生物体基本的结构和功能单元,生命科学研究的终极目标便是揭示活体内所有细胞的动态和功能。与有放射性危害的同位素示踪法以及只能用于观察和分析死细胞的电子显微镜、质谱分析等细胞生物学研究方法相比,以生物分析材料（荧光探针）和荧光显微镜为基础的荧光成像技术给完整细胞安装了一个“内窥镜”,最大限度降低了对活细胞的损伤,使得人们能够实时、原位地观测活细胞内细胞器、生物分子及其动态变化。因此本论文的研究内容主要包括以下两个方面:（1）脂滴及其相关细胞器荧光探针的研制,包括高保真、无噪声成像脂滴的界面靶向型荧光探针以及双色、同时区分成像脂滴和内质网的单分子双靶标荧光探针;（2）侧链工程策略及其衍生的荧光探针,包括通过侧链工程策略调控荧光染料透膜性以及以此为基础研制系列新型荧光探针。细胞器是真核细胞的重要组成成分。脂滴作为细胞内一种新兴的高度动态的细胞器,由含甘油三酯与胆固醇酯的中性内核和表面分布有多种蛋白的磷脂单分子层组成。它们在调节细胞能量稳态、保护细胞免受脂毒性和脂凋亡过程中扮演着重要的角色,而且它们的异常与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化和肥胖等多种疾病的发生密切相关。因此通过荧光探针专一地可视化脂滴对于揭示脂滴生物学及相关生理和病理的发生、发展具有重要作用。然而目前的脂滴探针都是基于脂滴内部的疏水性内核设计而成的,这些亲脂性的探针选择性较差,无法区分脂滴和细胞内其它亲脂性环境。为了解决这一问题,基于脂滴独特的单层膜界面结构,我们首次提出利用界面靶向策略设计脂滴专一性探针。通过将阳离子合理地引入到亲脂性荧光团（NBD）,设计合成了两亲性荧光探针。其NBD部分能够通过强疏水相互作用完全嵌入脂滴的无水内核,同时阳离子部分能够通过静电相互作用精确地定位在磷脂单层的极性壳上。这种界面靶向的方式实现了两亲性探针对脂滴超高选择性,并实现了脂滴的高保真成像。利用界面靶向探针,我们成功监测了细胞中脂滴大小、形态方面的变化,并进一步在双光子显微镜下观察到肝组织的异常。因此界面靶向探针有望用于脂肪肝的早期检测。在上述界面靶向脂滴探针研究的基础上,本论文进一步研制了双色、同时区分成像脂滴和内质网的单分子双靶标荧光探针。作为细胞内一种新兴的高度动态的细胞器,脂滴不仅具有其独立的功能,而且与细胞内多种细胞器相互作用,构成了细胞器互作网络的重要部分。特别地,脂滴与内质网的关系十分密切,目前一种主流的观点认为脂滴源于内质网,因此研究脂滴和内质网的相互作用对于理解脂滴生物学以及解析细胞器互作网络具有十分重要的意义。但是目前通过电子显微镜或脂滴蛋白质组方法都无法在活细胞中揭示二者之间的互作关系。而利用分别染色两种细胞器的荧光探针组合虽然可以实现两种细胞器的同时观测,但同时也会带来一系列问题,包括不同步的光响应、复杂的染色过程以及增大的细胞毒性。为了解决这些问题,开发可双色、同时区分成像活细胞内脂滴和内质网的单分子双靶标荧光探针势在必行,目前这类探针还尚未见报道。在本论文中,我们充分利用了脂滴和内质网水含量不同的本征区别,以具有激发态分子内质子转移（ESIPT）性质的3-羟基黄酮作为平台研发了对水含量变化极为敏感的探针。在水含量较多的内质网上,ESIPT过程受到抑制,探针发出了短波长的荧光,而在无水的脂滴中,ESIPT过程的发生使得探针主要发出了长波长的荧光。因此首次实现了利用单一荧光探针双色、同时区分成像脂滴和内质网的目标。利用这类探针,我们也对脂滴和内质网的相互作用进行了初步的探究,发现新生的脂滴位于内质网区域,且与内质网具有相似的荧光颜色,这为脂滴源于内质网的科学假说提供了新的依据。在设计和研发荧光染料或探针时,首先需要考虑它们对活细胞可交付性。但是细胞质膜严格的选择性使怎样把外来荧光染料无损的交付到活细胞中成为一项具有挑战性的工作。为此,人们开发了诸如微注射、透膜剂、脂质体等各种方法。但是这些方法都需要直接对活细胞进行强制性处理,造成了不可逆的破坏。相比以上方法,AM酯负载技术不再通过处理细胞来增大透膜性,而是通过酯化染料分子使其透膜。但是这一方法也存在自身的局限性,只适合用于改造含有羟基或羧基的荧光染料。而且由于AM酯易被脂肪族胺裂解,要求细胞培养基中不能含有氨基酸,也不能含有初级或者次级胺。在本论文中,我们首次提出利用侧链工程策略调控分子的膜吸附/解离过程来改善其交付性。基于苯乙烯基吡啶盐构架,我们合成了一系列含有不同长度烷基侧链的染料。系统的实验和理论研究表明随着烷基链长度的增加,分子的透膜能力先增强后降低。在合适长度时,染料的透膜性得到显著提高,可在30 s内完成细胞质交付。超好的透膜性也使得lnM的超低浓度成像和组织的深层成像成为可能。此外,利用这一策略,通过修饰合适长度的烷基侧链,我们也成功改造了一类无法透膜的分子,使之能够顺利进入活细胞。该策略简单易行,不会对细胞造成破坏,而且具有一定的普适性,因此可作为显著改善荧光染料透膜性的首选方法。在上述侧链工程策略研究的基础上,我们发现苯乙烯基吡啶盐构架具有优异的荧光性质,可以作为与荧光素、罗丹明类似的荧光探针平台。因此基于该分子骨架,我们旨在开发尽可能多的荧光探针。通过调控苯乙烯基吡啶盐构架的侧链长度,我们进一步发现侧链长度不仅会影响染料分子的透膜性,同时也会影响其插入磷脂双分子层的深度。当烷基侧链长度在6-10之间,探针具有极好的透膜性,能够以lnM的超低浓度着色线粒体,有效避免了聚集诱导淬灭问题;同时其荧光强度强烈地依赖于MMP,因此可实时原位监控MMP的变化。当烷基链长度在12-14时,探针不仅能够通过静电作用靶向线粒体,而且与线粒体内膜脂双层之间还存在强的疏水作用,因此这些探针不受MMP的影响,可用于长期追踪线粒体。当烷基链长度为18时,探针能够稳定地绑定在细胞质膜上;同时其分子量小、优异的双光子红光发射的特点有利于深层组织成像,能够清晰地显示大鼠骨骼肌组织中细胞质膜的精细结构。因此,基于苯乙烯基吡啶盐构架,我们研制了超低浓度的线粒体膜电位（MMP）探针、非反应型的线粒体追踪剂以及成像组织的细胞质膜探针。综上,从基础研究的角度,本论文提出了利用靶标独特的结构特征及不同靶标之间的本征区别设计荧光探针的新策略,对未来新靶标探针的设计具有启发性;而且提出了利用侧链工程策略调控荧光染料透膜性,解决了荧光染料交付性的基本问题。从应用研究角度,本论文研发的荧光探针将有助于生物学家和医学工作者对脂滴及其互作网络、以及线粒体和细胞膜的深入研究。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 郭丽方
导师: 于晓强,刘志强
关键词: 脂滴,界面靶向,单分子双靶标,内质网,侧链工程,透膜性,荧光探针
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 山东大学
分类号: Q2-33;O657.3
DOI: 10.27272/d.cnki.gshdu.2019.000995
总页数: 274
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