羊口疮病毒ORF019、ORF020基因原核表达及ORF019蛋白多克隆抗体的制备

论文摘要

羊口疮又称羊传染性脓疱皮炎病（contagious ecthyma,CE）,它是由副痘病毒属成员羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）感染引起的一种人畜共患病。人、绵羊和山羊可通过接触感染发生的急性传染性皮肤病,这种皮肤性痘病毒已经发展出一系列机制,逃避人和动物的宿主免疫系统的监控。研究发现ORFV ORF019、ORFV ORF020基因分别编码的蛋白与VACV（vaccinia virus）的E2L和E3L蛋白为直系同源物,其中E3L蛋白通过隔离dsRNA来抑制INF系统,而E2L存在于感染细胞的成熟病毒粒子中,对病毒粒子的转运起着至关重要的作用。但目前对ORFV ORF019和ORF020基因分别编码的E2L和E3L蛋白的功能研究较少。因此,通过对ORFV的ORF019和ORF020基因编码蛋白的表达研究可为羊口疮的免疫诊断和免疫预防提供科学依据。1.ORFV ORF019和ORF020克隆及同源性分析参考GenBank中登录的ORFV OV-SA00株的基因组序列（登录号:AY386264）,根据ORF019和ORF020基因序列,运用Oligo6.0生物信息学软件分别设计一对特异性引物,以提取的ORFV/QH02/2010毒株基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增ORF019和ORF020,然后构建原核表达载体pET-32a（+）,转化DH5α感受态细胞,经PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序分析。结果显示:成功构建了重组质粒pET-32a-ORF019、pET-32a-ORF020。其中ORF019基因和ORF020基因位于ORFV基因组的中心保守区区域,第19个和20个开放阅读框,约编码84 ku、20 ku大小蛋白。通过同源性分析发现2个基因在国内ORFV毒株中具有较高的保守性,在副痘病毒属的同源性较低。2.ORFV E2L蛋白和E3L蛋白的原核表达及纯化将构建的原核表达重组质粒pET32a-ORF019和pET32a-ORF020转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLys感受态细胞。经优化温度,使得到较大的表达量。经可溶性分析融合蛋白E2L以包涵体的形式存在,融合蛋白E3L存在于上清中。用镍亲和层析法纯化目的蛋白,最后用Western-blot鉴定诱导表达的目的蛋白具有较好的反应原性。3.抗ORFV E2L蛋白多克隆抗体的制备和鉴定用纯化的E2L融合蛋白制备免疫原,经背部皮下多点注射新西兰兔,制备兔抗ORFV E2L蛋白多克隆抗体,利用间接ELISA方法检测E2L多克隆抗体效价。结果表明,制备的兔抗多克隆抗体的效价可达1:128 000以上,并用Westernblot验证E2L蛋白具有较好的免疫原性,说明ORFV E2L重组蛋白具有良好的抗原性。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 外文缩略词表
• 第一部分 文献综述
•   第一章 羊口疮研究进展
•     1 羊口疮的流行病学与临床症状
•     2 病原学特征
•     3 ORFV的基因组学
•     4 ORFV的致病机理
•     5 ORFV的免疫逃避机制
•     6 ORFV的检测与诊断方法
•       6.1 电子显微镜观察
•       6.2 组织病理学诊断
•       6.3 病毒分离培养
•       6.4 ELISA检测
•       6.5 补体结合试验诊断
•       6.6 免疫印迹方法诊断
•       6.7 常规PCR检测
•       6.8 Real-tine PCR检测
•       6.9 环介导等温扩增技术
•     7 羊口疮疫苗研究
•     8 羊口疮的防治
•     9 本研究的目的意义
• 第二部分 试验研究
•   第二章 ORFV ORF019和ORF020 基因的克隆及同源性分析
•     1 材料
•       1.1 毒株、细胞和载体
•       1.2 试剂
•       1.3 仪器
•     2 方法
•       2.1 OT细胞的传代培养
•       2.2 ORFV的传代培养
•       2.3 ORFV ORF019和ORF020 基因克隆
•       2.4 PCR扩增
•       2.5 琼脂糖凝胶电泳
•       2.6 PCR产物回收、纯化
•       2.7 目的片段与表达载体pET32a（+）的连接
•       2.8 连接产物的转化
•       2.9 重组质粒的鉴定
•       2.10 同源性分析
•     3 结果
•       3.1 ORFV/QH02/2010株ORF019和ORF020 基因PCR扩增结果
•       3.2 ORFV/QH02/2010株ORF019和ORF020 基因重组质粒的鉴定
•       3.3 同源性分析结果
•     4 讨论
•   第三章 ORFV E2L和 E3L蛋白的表达及E2L蛋白多克隆抗体的制备
•     1 材料
•       1.1 菌株与重组质粒
•       1.2 实验动物
•       1.3 试剂
•       1.4 仪器
•       1.5 主要试剂的配制
•     2 方法
•       2.1 重组质粒表达菌的转化
•       2.2 重组菌的诱导表达
•       2.3 诱导温度的优化
•       2.4 目的蛋白的大量表达
•       2.5 目的蛋白的纯化
•       2.6 Western-blot检测
•       2.7 免疫原的制备
•       2.8 E2L多克隆抗体的制备
•       2.9 E2L多克隆抗体效价的测定
•     3 结果
•       3.1 重组蛋白的表达与鉴定
•       3.2 重组蛋白表达的适宜温度选择
•       3.3 融合蛋白的可溶性分析
•       3.4 重组蛋白的纯化
•       3.5 重组蛋白的Western-blot分析
•       3.6 ELISA法检测兔抗His-E2L多克隆抗体效价
•       3.7 兔抗His-E2L多克隆抗体特异性鉴定
•     4 讨论
•   第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈岩尔

导师: 薛慧文,景志忠

关键词: 羊口疮病毒,蛋白,原核表达,纯化,抗多克隆抗体

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学

分类号: S852.654

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000200

总页数: 71

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