辛基酚暴露对中国林蛙（Rana chensinensis）蝌蚪肠道基因表达及菌群结构的影响

论文摘要

辛基酚（octylphenol,OP）是烷基酚聚氧乙烯醚（alkylphenol polyoxyethylene ethers,APEs）的降解产物之一,作为粘合剂、增塑剂和表面活性剂等被广泛运用于工农业生产及日常生活中,已造成大面积的水域环境污染。两栖动物的孵化和幼体发育在水域进行,成体营水陆两栖生活,水域化学污染是致使两栖动物数量下降的重要因素之一。研究表明,OP暴露可对动物肠道、肝脏以及肾脏等器官产生严重的负效应。肠道作为参与机体代谢的重要器官,其生理功能除消化和吸收外,还参与内分泌和免疫等多种活动。肠道是多种共生菌的主要宿主,协调共生对于维持正常的消化功能甚至机体的健康至关重要。然而,肠道菌群的组成具有高度多样性,容易受环境变化、饮食和微生物感染等因素的影响,从而导致肠道菌群结构失调,进而对宿主健康造成威胁。有证据表明,肠道菌群失调是包括糖尿病、肥胖症、心血管疾病、炎症性肠病等多种疾病发生的重要原因。在水生动物,水域中的化学污染物可通过皮肤、鳃和肠道等器官侵入机体,而肠道是最为重要的途径。所以,研究污染物对于肠道结构与功能以及肠道菌群结构与丰度的影响对深入探讨该外源化合物干扰机体生长发育的机制是不可或缺的。为探讨OP对两栖动物肠道结构及肠道菌群的影响,本研究以中国林蛙（Rana chensinensis）幼体为材料,将Gs 25-38期蝌蚪分别暴露于0,10-8,10-7和10-6 mol/L OP水溶液中共50天,直观测量比较不同浓度OP处理后Gs 38期蝌蚪的体长、肠长、体重及肠重;并取该期蝌蚪肠道做病理切片,观察其显微结构变化。然后,用Illumina转录组测序技术,构建肠道cDNA文库,分析OP处理后的基因表达谱。用qRT-PCR技术检测肠道中脂肪消化和吸收相关基因的表达,验证cDNA文库的可靠性。最后,通过对肠道菌群的16S rRNA 基因V3-V4片段进行高通量测序,分析菌群结构和丰度变化。主要结果和结论如下:1.形态学实验结果显示,OP可提高中国林蛙蝌蚪的增重速率。与对照组相比,在10-8 mol/LOP组,Gs 38期蝌蚪的肠重显著增加;在10-7、10-6 mol/LOP组,蝌蚪体重、肠长和肠重均显著增加。设想可能与脂肪代谢障碍有关。2.组织学观察显示,在对照组蝌蚪中,其肠上皮细胞排列紧密且均匀,所有的细胞均显示出良好的细胞质边界。OP处理组蝌蚪中的结果与对照组基本类似,表明OP对肠道的显微结构无明显影响。3.转录组测序显示,在林蛙蝌蚪肠道cDNA文库中,共有15个与脂肪消化和吸收相关的基因,并分析了 OP处理之后它们的表达图谱。qRT-PCR检测结果表明,APOA-I和APOB-48的表达水平在10-6 mol/LOP组显著上调,而CLPS,CD36,LIPASE和I-FABP的表达在该浓度显著下调。其结果与转录组数据基本一致,证明转录组数据是可靠的。从上述差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的功能分析设想,OP暴露可干扰蝌蚪肠道的脂肪消化和吸收通路,对其功能造成潜在干扰。4.对肠道微生物16S rRNA基因测序,从对照组和所有OP处理组（10-8,10-7和10-6 mol/L）的蝌料肠道内容物中共获得168种分类操作单元（operational taxonomic units,OTUs）。差异OTU分布和肠道微生物α-多样性结果显示,与对照组相比,10-7 mol/LOP组肠道微生物多样性显著下降,而10-6mol/LOP组微生物多样性无显著变化。其原因有待进一步分析和研究。5.肠道微生物β-多样性结果显示,在门阶元,与对照组相比,10-6 mol/LOP组拟杆菌门的丰度显著增加,而变形菌门和厚壁菌门的丰度显著降低。在属阶元,气单胞菌属的丰度在10-8 mol/L OP处理组中显著增加。表明OP暴露可改变中国林蛙蝌蚪肠道微生物群落的结构组成。6.主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）与样本层级聚类分析显示,对照组和10-8 mol/LOP组蝌蚪肠道微生物群落聚为一组,而10-7与10-6 mol/L OP组各聚为一组。表明10-7、10-6 mol/LOP暴露可改变肠道菌群结构,且效应存在差异,而10-8 mol/LOP暴露不改变菌群结构。7.肠道微生物群落的功能预测显示,10-6 mol/LOP显著降低了大部分代谢通路的丰度,提高了蝌蚪患癌症、传染病和代谢疾病等的风险。综上所述,OP暴露可提高蝌蚪的增重速率,影响与脂肪消化和吸收相关的基因的表达。此外,OP可改变肠道微生物的多样性、结构及组成,影响机体的代谢水平,增加机体患病的风险,进而威胁蝌蚪的健康。本研究结果有助于理解酚类化合物对两栖动物幼体生长发育的影响,也为未来研究酚类干扰脂肪的消化和吸收提供一个有效的基因背景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Chapter 1 Review
•   1.1 Octylphenol
•     1.1.1 The chemical structure and characteristics of octylphenol
•     1.1.2 Sources of octylphenol in the environment
•     1.1.3 The effects of octylphenol on animals
•   1.2 The amphibian digestive system
•   1.3 RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
•   1.4 Intestineal microbiota
•     1.4.1 Functions of intestinal microflora
•     1.4.2 Intestinal microbiota and diseases
•     1.4.3 Analysis methods for intestinal microflora
•   1.5 Chinese brown frog （Rana chensinensis） is an excellent model to study thetoxicity effects of environmentally xenobiotic compounds
• Chapter 2 Octylphenol alters gene expression of intestine in Ranachensinensis tadpoles
•   2.1 Introduction
•   2.2 Materials and methods
•     2.2.1 Animals husbandry
•     2.2.2 Solution preparation and OP exposure experiment
•     2.2.3 Morphometric and histological analysis
•     2.2.4 RNA extraction, cDNA library construction, and lllumina sequencing
•     2.2.5 De novo assembly and functional annotation
•     2.2.6 Differential gene expression analysis
•     2.2.7 Quantitative real time RT-PCR validation
•   2.3 Results
•     2.3.1 Morphometric parameters
•     2.3.2 Histological analysis
•     2.3.3 RNA-sequencing, unigene assembly and annotation
•     2.3.4 Unigenes functional classification
•     2.3.5 Identification of differentially expressed unigenes
•     2.3.6 Functional annotation of differentially expressed unigene set
•     2.3.7 The expression level of genes related to the fat digestion and absorption
•     2.3.8 Quantitative Real-time RT-PCR Validation
•   2.4 Discussion
• Chapter 3 Effects of octylphenol on intestinal microbiota in Ranachensinensis tadpoles
•   3.1 Introduction
•   3.2 Materials and methods
•     3.2.1 Animals husbandry
•     3.2.2 Solution preparation and OP exposure experiment
•     3.2.3 DNA extraction and PCR amplification of 16S rRNA gene
•     3.2.4 Illumina Miseq sequencing and processing of sequencing data
•     3.2.5 Bioinformatic and statistical analysis
•   3.3 Results
•     3.3.1 General DNA sequencing observations of gut microbiome
•     3.3.2 Taxonomic diversity
•     3.3.3 Unique and shared microbial taxa among different OP concentration exposure
•     3.3.4 Composition of the intestinal microbiota at various taxonomic levels
•     3.3.5 Comparison of dominant microbial communities among four exposure groups
•     3.3.6 Functional prediction of intestinal microbial community
•   3.4 Discussion
• Chapter 4 Conclusion
• References
• 致谢
• 攻读硕士学位期间研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高晋舒

导师: 张育辉

关键词: 辛基酚,中国林蛙,脂肪的消化和吸收,肠道微生物,转录组

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 陕西师范大学

分类号: X174

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.000102

总页数: 81

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