论文摘要
多药耐药（Multidrug-resistant,MDR）质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。本文旨在探究临床分离的多重耐药菌株的耐药表型、其携带的多药耐药质粒的全序结构和接合转移能力,并对相关不相容群质粒的结构特征及其携带的耐药基因相关移动元件进行比较基因组学分析,具体分为两个部分:一是IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的结构基因组学分析,二是携带未知复制子的多药耐药质粒pTEM-2262的比较基因组学分析。第一部分旨在分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM（GenBank登录号MF156697）的基因组特征,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平转移机制。利用接合转移和电转化实验验证质粒pBTR-CTXM是否具备自主接合转移的特性;使用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定相关菌株对多种抗生素的药物敏感性;构建Mate Pair文库,并进行细菌全基因组高通量测序和质粒的结构基因组学分析。实验结果表明临床分离菌株BTR的blaCTX-M-15、mph（A）、erm（B）和tetA（B）等耐药基因均位于大小为144 939 bp的质粒pBTR-CTXM上。可能是由于接合转移区缺少部分基因,质粒pBTR-CTXM需要在菌株BTR内质粒pNDM-BTR的协助下,共转移到受体菌大肠杆菌EC600中,但可通过电转化进入受体菌大肠杆菌DH5α中,属于可移动质粒。在基因组结构上,质粒pBTR-CTXM含有三个复制子RepFII、RepFIA和RepFIB,属于IncFII-FIA-FIB型质粒,故将第一个完整测序的IncFII-FIA-FIB型质粒pRSB107（GenBank登录号AJ851089）、质粒pBTR-CTXM（本文）和与质粒pBTR-CTXM覆盖度、核酸一致性最高（86%+99%）的质粒pRSB225（GenBank登录号JX127248）纳入基因组学分析。研究发现质粒pBTR-CTXM具备IncFII-FIA-FIB型质粒典型的骨架区结构,其多重耐药区由新复合型转座子Tn6492、Tn2残余、Tn10残余、ISEcp1-bla CTX-M-15-Δorf477转座单元和一些插入序列组成。IS26、In54、chrA-orf98转座单元、IS26-mph（A）-mrx-mphR（A）-IS6100转座单元、ΔTn6295和Tn6415通过复杂的转座和同源重组事件形成了一个新的复合型转座子Tn6492。本部分结论是质粒pBTR-CTXM介导了大肠杆菌BTR和电转子BTR-CTXM-DH5α对单环β-内酰胺类、部分头孢菌素类、青霉素类（不含酶抑制剂）、大环内酯类和四环素类等抗生素的耐药性。质粒pBTR-CTXM中Tn10残余、新复合型转座子Tn6492和ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元共同介导大肠杆菌BTR株的多重耐药以及相关耐药基因的水平传播。IncFII-FIA-FIB型质粒pRSB107、pBTR-CTXM和pRSB225的骨架区中存在两个插入“热点”,即pemK与ahr之间和orf249和orf165之间,可整合不同的外源序列,尤其是含有耐药基因的移动元件,从而促进了耐药基因在不同种属细菌间的水平传播。第二部分旨在分析临床分离株弗氏柠檬酸杆菌2262中属于未知不相容群的多药耐药质粒pTEM-2262（GenBank登录号MG387191）的基因组特征,并探究其携带的两个复制子repA和repB在质粒复制过程中的作用。菌株2262在2016年分离于山东省泰安市中心医院神经内科的一位89岁脑梗死男性患者的尿液标本。多位点序列分型MLST发现菌株2262的序列型为新型171,且携带五个新的管家基因亚型clpX（86）、dnaG（69）、fadD（94）、lysP（80）和mdh（76）。接合转移实验表明携带blaTEM-1、qnrA1、mph（A）和tet（D）耐药基因的质粒（命名为pTEM-2262）可以从供体菌株2262转移到受体菌大肠杆菌EC600中,验证了质粒pTEM-2262可自主接合转移的特性。药敏实验显示菌株2262和接合子2262-TEM-EC600均对氨苄西林、氨苄青霉素/舒巴坦、哌拉西林、环丙沙星、四环素和庆大霉素耐药。此外,菌株2262对妥布霉素、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和呋喃妥因耐药。构建大片段Mate Pair文库并进行细菌全基因组测序,发现质粒pTEM-2262的核苷酸序列长度为262 833 bp,包含两个未分类的复制子repA和repB。为探究复制子repA和repB在质粒复制过程中的作用,采用无痕敲除技术（Scarless Cas9 Assisted Recombineering,no-SCAR）构建了质粒pTEM-2262的repA或repB缺失突变体,并用脉冲场凝胶电泳（Plus Field Gel Electrophoresis,PFGE）和Southern印迹杂交验证。结果表明,在pTEM-2262的复制过程中,repA是必需的,而repB是非必需的。基因组学分析显示,质粒pTEM-2262的MDR区域具有复杂的镶嵌结构,由In37、ΔTn2、Tn6545、ΔTn6415、截短的fosA岛和截短的IS26-tetA（D）-tetR（D）-IS26转座单元组成。BLAST分析显示GenBank中共有四个质粒（pKrDSM16656L、pKPCCAV1321-244、p705SK31和pCW001）与质粒pTEM-2262属于同一个不相容群。然而,该不相容群的详细结构特征尚未有报道。本文对质粒pTEM-2262和其它四个已测序的同类群质粒进行比较基因组学分析发现,这五个质粒具有保守的骨架区结构,而大量的且不同的外源序列主要整合在orf597和orf504之间以及orf393和orf405之间。本文是首次对pTEM-2262类质粒进行深入的基因组结构与比较基因组学的研究,这些发现有助于进一步了解肠杆菌科中多药耐药质粒介导的耐药基因水平转移机制。未来应加强对pTEM-2262类质粒的常规监测和分子流行病学研究,以进一步促进对这种未知不相容群质粒的进化和多样化的理解。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李曼莉
导师: 赵宝华
关键词: 多药耐药,细菌,质粒,移动元件,耐药基因
来源: 河北师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 河北师范大学
分类号: Q78
DOI: 10.27110/d.cnki.ghsfu.2019.000004
总页数: 82
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- [1].IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的结构基因组学分析[J]. 微生物学通报 2019(01)