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甲基-CpG结合结构域蛋白2（MBD2）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1（CREB1）抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的研究

2020-12-08阅读(837)

甲基-CpG结合结构域蛋白2（MBD2）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1（CREB1）抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）能够引发猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,是使怀孕母猪发生流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸困难的一种高度传染性疾病。自1987年在美国首次发现PRRS以来,该病迅速传播到所有主要养猪国,是影响全球养猪业的最重要疾病之一。我国于1996年初次报道PRRS,2006年一种高致病性HP-PRRSV引发的高致病性PRRS的出现并流行,给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。实验室课题组前期结果发现miR-373能通过负向调控Ⅰ型干扰素促进PRRSV的复制,而靶基因预测软件结果表明甲基-CpG结合结构域蛋白2（MBD2）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1（CREB1）可能是miR-373的靶基因。那么miR-373是否通过靶向MBD2和CREB1而促进PRRSV复制,而且MBD2和CREB1是否是抗PRRSV的宿主内源性蛋白,目前还不清楚。本实验首先构建MBD2和CREB1的3’-UTR报告质粒,分别与miR-373模拟物和抑制物及其各自对照共转染293T细胞,双荧光素酶报告实验结果表明MBD2和CREB1是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PPRSV感染MARC-145细胞,24h、36h和48h后,分别取样,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和western blots实验结果表明PRRSV感染下调MBD2和CREB1的mRNA和蛋白的表达水平。为了确证MBD2和CREB1是否是抗PRRSV的宿主内源性蛋白,我们用真核表达载体pcDNA3.1-Flag分别构建了 MBD2和CREB1的真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-MBD2 和 pcDNA3.1-Flag-CREB1,将真核表达质粒 pcDNA3.1-Flag-MBD2 和pcDNA3.1-Flag-CREB1 分别转染 MARC-145 细胞,24h 后,按 MOI=0.1 接种 PRRSV,24h 后收获细胞,TCID50的实验结果表明过表达MBD2和CREB1均能降低PRRSV滴度,而qRT-PCR和western blots的结果则表明MBD2和CREB1均能降低PRRSV的载量;相反,MBD2和CREB1的siRNA实验表明下调二者表达均有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。最后,通过基因缺失实验,构建MBD2和CREB1部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域以及CREB1的bZIP结构域可能在MBD2和CREB1抑制PRRSV复制起关键的作用。综上所述,本研究发现MBD2和CREB1是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域以及CREB1的bZIP结构域可能在MBD2和CREB1抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2和CREB1的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。因此,本研究进一步揭示了 PRRSV逃逸宿主清除的分子机理,并为PRRSV的防控提供了新靶点。为开发基于该内源性抗病毒蛋白的抗病毒治疗提供了理论依据。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • 第一章 文献综述
  •   1 猪繁殖与呼吸综合征
  •   2 PRRSV的病原学特性
  •     2.1 PRRSV的基因组特征
  •     2.2 PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白
  •     2.3 PRRSV的感染
  •   3 PRRSV引起宿主免疫反应
  •     3.1 先天性免疫
  •     3.2 获得性免疫
  •   4 miRNA调控PRRSV的感染和复制
  •   5 MBD2概述
  •     5.1 DNA甲基化
  •     5.2 MBD蛋白家族
  •     5.3 MBD2结构及功能
  •   6 CREB1概述
  •     6.1 转录因子CREB1及其结构和功能
  •     6.2 CREB1的磷酸化和激活
  •     6.3 CREB1蛋白家族
  •     6.4 CREB1在免疫功能中的作用
  •   7 研究目的和意义
  • 第二章 MBD2和CREB1拮抗PRRSV复制的研究
  •   1 引言
  •   2 材料
  •     2.1 病毒与细胞材料
  •     2.2 载体
  •     2.3 DNA引物和siRNAs的合成
  •     2.4 主要试剂
  •     2.5 主要试剂的配制
  •     2.6 主要仪器设备
  •   3 方法
  •     3.1 真核表达载体的构建
  •     3.2 MBD2和CREB1报告载体的构建
  •     3.3 用TCID50法定量病毒
  •     3.4 传代细胞培养、复苏与冻存
  •     3.5 脂质体法转染、病毒增殖实验
  •     3.6 实时荧光定量PCR
  •     3.7 双荧光素酶报告实验
  •     3.8 Western blots检测蛋白表达
  •     3.9 数据统计学分析
  •   4 结果与分析
  •     4.1 构建真核表达载体pcDNA3.1-Flag-MBD2和pcDNA3.1-Flag-CREB1
  •     4.2 验证MBD2和CREB1是miR-373的靶基因
  •     4.3 PRRSV抑制MARC-145细胞中MBD2和CREB1的表达
  •     4.4 MBD2和CREB1抑制PRRSV的复制
  •     4.5 MBD2和CREB1不同结构域对PRRSV复制的影响
  •   5 讨论
  • 第三章 全文总结
  • 参考文献
  • ABSTRACT

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵慧君

    导师: 张改平

    关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,甲基结合结构域蛋白

    来源: 河南农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 河南农业大学

    基金: 国家自然基金重大基础研究计划(No.31490600),国家自然科学基金青年基金(No.31302073),河南省自然科学基金(182300410077),农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室开放课题(PKLAI20170605),河南省高等学校重点科研项目(17A180006),河南师范大学优秀青年科学基金(校20170031)

    分类号: S852.651

    DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000173

    总页数: 65

    文件大小: 4799K

    下载量: 28

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