论文摘要
目的:克隆表达家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因（Clip-serine protease gene of Musca domestica,Clip-Msp）和C型凝集素基因（C-type lectin gene of Musca domestica,Mdctl）,并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:从课题组前期构建的微生物感染后免疫相关基因文库中筛选得到高表达基因Clip-Msp（GeneID:LOC101901626）和Mdctl（GeneID:LOC101890789）,然后依据NCBI网站上的预测序列设计引物,以家蝇三龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增目的片段。使用生物信息学软件对它们的序列及编码蛋白作分析和预测。通过基因工程的方法,构建pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl重组质粒,随后导入到大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达。表达产物和Ni-IDA Agarose纯化蛋白用SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。以GAPDH作为内参,运用实时荧光定量PCR方法检测Clip-Msp在家蝇三龄幼虫感染白假丝酵母菌后3h、12h、24h以及48h不同组织（体壁、脂肪体、血淋巴、唾液腺、肠道、马氏管和气管）中的表达情况。结果:家蝇Clip-Msp基因开放阅读框（ORF）长度为1524 bp,编码蛋白长度507个氨基酸,其理论分子量约为56320.1 Da,等电点约为8.52。蛋白质在溶液中性质不稳定;总体疏水性较高,无信号肽,属于非经典分泌型蛋白。Clip-Msp蛋白的N端存在一个Clip结构域,C端有一个TrypSPc催化结构域,属于单催化结构域Clip-丝氨酸蛋白酶超家族。Mdctl基因ORF长度为333 bp,其蛋白包含110个氨基酸残基,分子量为13131.42 Da,等电点为4.49,信号肽范围为1-22位氨基酸,是分泌型蛋白。Mdctl蛋白中存在Clect结构域,属于C型凝集素超家族。成功构建pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl表达质粒,经IPTG诱导后两种重组蛋白均在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,其分子量与理论值相一致。实时荧光定量PCR结果显示:白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后,Clip-Msp基因在所有检测组织中表达均上调,不同时间点、不同组织中表达有极显著差异（P<0.05）。3h时以血淋巴中表达量增加最高;12h时以脂肪体、气管、唾液腺和肠道中表达量增加为主,其中脂肪体内的相对表达量最高;24h时主要在肠道中表达增加最明显,脂肪体次之;48h时血淋巴中表达量高于其它所有组织。结果分析得出:Clip-Msp基因主要分布在血淋巴、脂肪体和肠道中。结论:家蝇Clip-Msp由507个氨基酸组成,无信号肽,为Clip-SP家族新成员。家蝇三龄幼虫在白假丝酵母菌感染后,虫体组织中Clip-Msp基因的表达随时间的推移呈现先升高后降低的趋势,其中以血淋巴、脂肪体和肠道的表达量增加最为明显。Mdctl基因编码家蝇新凝集素,属于C型凝集素超家族。本研究成功建立pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl原核表达体系,获得了它们的重组蛋白。结果提示Clip-Msp和Mdctl可能参与了家蝇真菌感染的免疫反应,也为进一步对家蝇Clip-Msp和Mdctl的研究提供了基础。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 常振策
导师: 吴建伟
关键词: 家蝇,原核表达,时空表达,白假丝酵母菌
来源: 贵州医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 贵州医科大学
分类号: R384.2
总页数: 74
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- [1].家蝇三龄幼虫Mdctl基因原核表达及生物信息学分析[J]. 贵州医科大学学报 2020(02)