化学诱导成纤维细胞为子宫腺上皮及其功能研究

论文摘要

在世界范围内,不孕不育疾病的患病率大概是15%,其中由于子宫因素导致的不孕症占女性总人口的3%-5%。目前,治疗由子宫因素导致不孕症的方法主要有代孕及子宫移植,其中子宫移植是被人们主要接受的治疗子宫性不孕症的方法。然而,目前子宫的器官来源主要是遗体及活体捐献,有限的器官来源及伦理问题限制了这一技术的广泛应用。随着再生医学的发展,结合组织材料学和生物工程学制造的人工子宫,作为可替代的胚胎孵化器,为子宫受损导致的不孕症患者带来了新的希望。人工子宫需要完整的结构和充足的细胞来源,以实现子宫的结构和生理功能的重建,但目前目的细胞来源不足极大地阻碍了生物人工子宫的临床应用。迄今为止,体细胞重编程和转分化技术已经有了快速的发展。通过病毒介导转录因子或者小分子化合物等方法都可以稳定的将成纤维细胞转变为具有多能性或特定功能的细胞（神经元、肝细胞、心肌细胞等）,为再生医学提供了潜在的细胞来源。其中病毒等介导的转录因子重编程方法在遗传学上存在风险,且多能性细胞的无限扩增能力所致的潜在致瘤风险也极大地限制了其在临床上的应用。而转分化方法具有目的细胞功能明确,避免了体细胞转变为多能性细胞的过程,从而减少了致瘤性的风险等优势。与病毒介导的转录因子重编程方法相比,小分子化学诱导的方法具有明确的结构和功能、操作简单、易于调控、遗传学危害风险较小且易于标准化等优势,使得小分子转分化而来的功能细胞在再生医学的临床应用中脱颖而出。目前常用的小分子化合物有表观遗传调节剂、信号通路调节剂、代谢调节剂和核受体激活剂和抑制剂等种类。在本研究中,我们利用小分子化合物诱导的方法,使用小鼠胚胎成纤维细胞作为起始细胞并对其进行转分化诱导。诱导的培养体系中选择能够激活低氧诱导因子的脯氨酸羟化酶抑制剂,抑制成纤维细胞命运的AlK抑制剂和能够激活WNT,促进细胞增殖的GSK抑制剂,将成纤维细胞转分化为子宫腺上皮细胞（Chemical-induced glandular epithelial cells,ciGE）。同时我们还使用Fsp1-Cre/ROSA26mTmG的转基因小鼠中分离出胚胎成纤维细胞,用来追踪成纤维细胞的命运变化。这些化学诱导得到的ciGE细胞能够形成上皮样克隆,并表达上皮特异性蛋白,在扩增培养基中能持续扩增超过20代,并维持稳定的核型,并且在免疫缺陷鼠皮下接种实验证明不具有成瘤性。通过生物信息学的比较分析,ciGE细胞与原代子宫腺上皮具有类似的基因表达模式。此外,我们还发现ciGE细胞中功能相关基因,包括雌激素和孕酮响应基因,以及胚胎着床相关基因,如Lif,Foxa2,Calca等均有明显上调。更重要的是,这些化学诱导ciGE细胞在体外培养的过程中能够自发的形成具有管腔结果的类腺体,同时ciGE细胞可以响应卵巢激素如雌激素及孕酮的刺激。将ciGE细胞和胚胎共培养时,ciGE细胞表现出比MEF细胞更好的细胞连接方式,使胚胎具有更好的延展性和侵入性。本研究为胚胎植入和子宫结构或功能丧失提供了一个体外研究模型,为子宫因素不孕症的治疗、子宫再生和人工子宫的构建提供了新的思路。该小分子化合物诱导组合具有细胞通透性好、操作方便、无免疫原性、易于标准化等优点。这些优点使其成为再生医学发展中一个具有竞争力的治疗策略,可以应用于子宫相关疾病,如子宫粘连、子宫结构异常等子宫因素导致的不孕症的临床治疗。尽管化学诱导转分化的分子机制有待于进一步研究,但我们的研究提供了一个线索:在体内通过小分子化学混合物的诱导,将受损或老化子宫的原位成纤维细胞诱导成为目的功能细胞,实现原位再生及受损功能恢复,为生物工程在再生医学中的应用提供助力。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 引言
•   1.1 不孕症的研究与发展
•     1.1.1 不孕症的成因与治疗
•     1.1.2 子宫因素不孕症的治疗与发展
•     1.1.3 胚胎着床与子宫接受态
•     1.1.4 再生医学在不孕症治疗中的应用前景
•   1.2 再生医学功能细胞的获得方法
•     1.2.1 原位功能细胞的获得
•     1.2.2 原代细胞分离与扩增
•     1.2.3 胚胎干细胞的建立与分化
•     1.2.4 体细胞重编程及再分化
•     1.2.5 细胞命运转分化
•   1.3 细胞重编程及转分化的化学方法
•     1.3.1 表观遗传调节剂
•     1.3.2 信号通路调节剂
•     1.3.3 代谢调节剂
•     1.3.4 核受体调节剂
•   1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验器材
•   2.2 方法
•     2.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备
•     2.2.2 胚胎成纤维细胞体的外诱导和培养
•     2.2.3 成纤维细胞的性别鉴定
•     2.2.4 诱导细胞核型分析
•     2.2.5 致瘤性的检测
•     2.2.6 RNA-Seq数据分析
•     2.2.7 细胞免疫荧光染色
•     2.2.8 定量PCR检测
•     2.2.9 腺体的自我组装
•     2.2.10 激素响应实验
•     2.2.11 统计学分析
•     2.2.12 Western Blot蛋白测定实验
•     2.2.13 体外胚胎制备
•     2.2.14 胶原培养材料的制备
•     2.2.15 胚胎的体外培养
• 3 结果与分析
•   3.1 化学诱导胚胎成纤维细胞转分化为子宫腺上皮
•     3.1.1 化学方法诱导胚胎成纤维细胞的上皮细胞转分化
•     3.1.2 ciGE细胞表达上皮细胞的特征基因
•     3.1.3 ciGE细胞来源于MEF细胞
•   3.2 ciGE细胞具有子宫腺上皮的特征
•   3.3 ciGE细胞具有稳定增殖的能力
•     3.3.1 ciGE细胞可以无限扩增
•     3.3.2 ciGE细胞不具有致瘤性
•   3.4 ciGE细胞在子宫重建中的应用
•     3.4.1 ciGE细胞在体外能够自发组装成为腺体样结构
•     3.4.2 ciGE细胞能够响应卵巢激素
•     3.4.3 ciGE细胞能够模拟体外胚胎植入过程
• 4 讨论
•   4.1 小分子化合物诱导方法
•   4.2 小分子化合物的优化
•   4.3 诱导ciGE的源头细胞
•   4.4 ciGE细胞的性别对其类子宫上皮功能的影响
•   4.5 ciGE细胞的生物学功能
•   4.6 ciGE细胞在再生医学中的应用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 袁雪薇

导师: 周琪

关键词: 转分化,小分子化合物,子宫腺上皮,子宫重建

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 东北农业大学

分类号: R318

总页数: 73

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