杀粉蝶菌素A1生物合成中调控蛋白PieR的功能研究

论文摘要

杀粉蝶菌素A1属于α-吡啶酮类抗生素,由于其可竞争性结合线粒体复合体I,因此具有抑制呼吸作用的活性。作为一种线粒体呼吸作用抑制剂,其对致病真菌活性较强并且对蚕和菜青虫具有显著的杀虫效果。在筛选抗肿瘤试剂的过程中发现杀粉蝶菌素A1能够抑制内质网上的应激蛋白GRP78,从而降低肿瘤细胞对细胞内毒性和抗肿瘤试剂的抵抗力并且其可以与糖基化杀粉蝶菌素A1协同作用,抑制人类恶性上皮瘤细胞丝状伪足的生长。此外,杀粉蝶菌素A可作为群体感应系统抑制剂,参与到由欧文氏杆菌引起的马铃薯软腐病防治中。因此,这种具有广泛生物活性的杀粉蝶菌素A1的生物合成机制研究无疑具有重要意义。前期研究中,已经成功鉴定了票霉素链霉菌杭州湾变种中杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇并推测出其生物合成途径。然而,生物合成基因簇中调控基因pieR的具体调控机制并不清楚。在本研究中,我们首先对PieR进行生物信息学分析,通过比对发现PieR属于SARP蛋白家族,其结构包含N端负责DNA结合的HTH结构域以及C端的细菌转录激活结构域。并且,通过结构预测发现HTH结构域呈现两端为β-折叠,中间为α-螺旋的结构,而C端由7个α-螺旋组成,这为之后的研究提供了一定的理论指导;然后,对pieR基因进行体内敲除和回补,通过发酵检测、HPLC分析,发现pieR基因的缺失使杀粉蝶菌素A1的产量有了明显的下降,而回补菌株能够成功回补回杀粉蝶菌素A1的产量。同时,过表达的菌株杀粉蝶菌素A1的产量相对于野生型的菌株也有2.3倍的提高。再通过生长测定排除pieR的敲除对菌株生长的影响后,确定pieR基因正调控杀粉蝶菌素A1的产生;另外,我们对杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的转录单元进行了确定,发现整个基因簇从属于同一转录单元;在确定转录单元之后,通过RT-qPCR技术检测pieR的敲除对基因簇中转录单元转录水平的影响,发现pieR的敲除使基因簇的转录水平有了很大的下降从而影响杀粉蝶菌素A1的产量;最后,体外表达PieR之后,通过EMSA和DNase I footprinting实验确定PieR作用于整个基因簇的上游,推测其通过与两个5 nt（5’-CCGGA-3’）的正向重复结合从而激活整个基因簇的转录。总之,本研究完善了杀粉蝶菌素A1生物合成机制,组合运用生物信息学、体内基因敲除及回补以及体外生化分析,确定了SARP蛋白家族的转录调控基因pieR正调控杀粉蝶菌素A1的生物合成,这些研究为通过转录调控工程优化杀粉蝶菌素A1的产量奠定了基础并且为构建高产菌株提供了切实可行的有效手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
•   1.1 链霉菌及其次级代谢产物
•   1.2 链霉菌次级代谢产物的高产改造
•   1.3 α-吡啶酮杂环类抗生素的研究
•   1.4 次级代谢合成的调控
•     1.4.1 碳源限制
•     1.4.2 磷酸盐调控
•     1.4.3 氨基酸代谢
•     1.4.4 金属离子限制
•     1.4.5 自动调控因子
•     1.4.6 调控蛋白
•       1.4.6.1 AraC/XylS家族
•       1.4.6.2 SARP家族
•       1.4.6.3 LuxR家族
•       1.4.6.4 LTTR家族
•     1.4.7 胞内小元件
•   1.5 课题研究的目的与意义
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 本研究所用菌株及质粒
•     2.1.2 本研究所用引物
•     2.1.3 本研究所用探针
•     2.1.4 本研究所用培养基
•     2.1.5 本研究所用试剂及缓冲液
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌种培养及保藏
•     2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
•     2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     2.2.4 质粒DNA钙转化大肠杆菌
•     2.2.5 电转化大肠杆菌
•     2.2.6 PCR扩增
•     2.2.7 链霉菌总DNA的提取
•     2.2.8 大肠杆菌与链霉菌两亲本接合转移
•     2.2.9 基因敲除
•     2.2.10 杀粉蝶菌素A1的发酵
•     2.2.11 杀粉蝶菌素A1的提取
•     2.2.12 杀粉蝶菌素A1的HPLC及LC-MS检测分析
•     2.2.13 链霉菌总RNA的提取
•     2.2.14 链霉菌总RNA反转录
•     2.2.15 分子克隆
•     2.2.16 一步克隆法
•     2.2.17 融合蛋白的表达及纯化
•     2.2.18 转录本的确定
•     2.2.19 转录水平检测
•     2.2.20 作用位点检测
•     2.2.22 DNA序列分析及结构预测
•     2.2.23 进化树分析
• 第三章 调控基因pieR的体内功能研究
•   3.1 前言
•   3.2 生物信息学分析
•   3.3 pieR基因的缺失、回补、过表达及菌株的生长测定
•     3.3.1 pieR基因缺失突变株的构建
•     3.3.2 野生型及pieR基因缺失突变株发酵产物的HPLC分析及LC-MS检测
•     3.3.3 野生型及pieR基因缺失突变株的生长曲线及生物量测定
•     3.3.4 pieR基因的回补、过表达及定量发酵检测
•   3.4 杀粉蝶菌素生物合成基因簇转录单元的确定
•   3.5 RT-qPCR技术检测pieR的缺失对转录单元转录水平的影响
•   3.6 本章小结
• 第四章 PieR结合DNA的体外检测
•   4.1 前言
•   4.2 PieR的异源表达
•     4.2.1 PieR（-）在BL21（DE3）及BL21（Rossetta）中的异源表达
•     4.2.2 pieR（-）密码子优化全化学合成后的异源表达
•     4.2.3 PieR（-）在不同载体中的表达
•     4.2.4 PieR的可溶性表达
•   4.3 PieR作用位点检测
•     4.3.1 凝胶迁移实验（EMSA）
•     4.3.2 DNase I footprinting实验
•   4.4 PieR的进化树分析
•   4.5 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 本研究的工作总结
•   5.2 本研究的创新点
•   5.3 研究工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李艳

导师: 由德林

关键词: 杀粉蝶菌素,转录调控,次级代谢

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q78

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002851

总页数: 78

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