星星草（Puccinellia tenuiflora）DREPPs基因克隆及功能解析

论文摘要

发育调节质膜多肽（DREPP）是一类与质膜相关的植物特异性蛋白,具有结合磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）、Ca2+/钙调蛋白（CaM）、微管和微丝等功能,在植物生长发育与逆境应答过程中发挥了重要作用。DREPP应答低温、干旱等逆境的分子机制已有研究,但是其盐碱应答分子机理尚未见报道。本研究以星星草(Puccinellia tenuiflora 为实验材料,在全基因组范围内分析了 PutDREPP家族组成,并克隆了PutDREPP1和PutDREPP2基因。进而利用生物化学和分子遗传学策略分析了PutDREPP1和PutDREPP2基因表达特性、蛋白质亚细胞定位,及其与Ca2+/CaM的结合能力,并通过分析PutDREPP1过表达拟南芥植株初步解析了其在逆境应答过程中的生物学功能。我们利用新近获得的星星草全基因组数据库,分析了PutDREPP基因家族组成,包括PutDREPP1和PutDREPP2,并克隆到PutDREPP1和PutDREPP2基因。生物信息学分析表明,PutDREPP1 ORF区域长度为609 bp,编码202个氨基酸;PutDREPP2 ORF区域长度为651 bp,编码216个氨基酸。PutDREPP1和PutDREPP2均具有DREPP家族蛋白功能结构域。星星草PutDREPP1和PutDREPP2分别与水稻（Oryza sativa）的OsDREPP1和OsDREPP2同源性最高。我们利用实时荧光定量PCR技术检测到PutDREPP1与PutDREPP2在星星草的根、茎、叶、花、叶鞘、花穗、花柄以及种子中均有表达。PutDREPP1在根中表达量最高,花穗中表达量最低。PutDREPP2在种子中表达量最高,叶中表达量最低;在75 mmol/L Na2CO3、100 mmol/L NaHCO3、200 mmo1/L NaCl、10 mmol/L H2O2、160 μmol/L CdCl2 以及 4℃胁迫时,除了根中的PutDREPP1在低温胁迫时受抑制表达,其余胁迫条件下叶和根中的PutDREPP1都受诱导表达。而根和叶中的PutDREPP2在100 mmol/LNaHCO3、200 mmol/L NaCl、160μmol/L CdCl2以及4℃时都受抑制表达。这暗示着PutDREPPs可能参与了盐碱、重金属、过氧化氢以及低温等胁迫的应答过程。通过构建pBI121-PutDREPP1-GFP和pBI121-PutDREPP2-GFP载体,并分别导入烟草（Nicotiana tabacum）叶片细胞和洋葱（Allium cepa）表皮细胞中进行瞬时表达,亚细胞定位结果表明,正常条件下PutDREPP1和PutDREPP2主要定位于质膜。通过PutDREPPs基因原核表达体系,诱导并纯化到His-PutDREPP1和His-PutDREPP2融合蛋白,经蛋白免疫印迹法验证了蛋白质纯度,并利用Ca2+/CaM结合实验初步证实了 PutDREPPs具有Ca2+/CaM结合能力。通过构建过表达PutDREPP1和PutDREPP2基因植物载体,并利用农杆菌侵染法分别获得过表达PutDREPP1和PuuDREPP2基因拟南芥植株。对过表达PutDREPP1基因拟南芥植株的耐盐性进行分析。在100 mmol/L和125 mmol/LNaCl胁迫下,过表达PutDREPP1基因拟南芥的根长和鲜重都优于野生型拟南芥。这表明PutDREPP1可能对盐应答具有正调控作用。我们的研究结果为深入认识DREPPs调控逆境应答的分子机制,以及进一步研究星星草等盐生植物盐碱应答分子机理提供了新的信息。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 盐碱胁迫对植物生长的影响
•   1.2 星星草盐碱应答机制研究进展
•     1.2.1 星星草盐碱应答的生理生态学研究
•     1.2.2 星星草盐碱应答转录组与蛋白质组学研究
•     1.2.3 星星草盐碱应答机制的分子生物学研究
•   1.3 植物DREPP蛋白功能研究进展
•     1.3.1 DREPP蛋白家族组成与结构特征
• 2+介导的PtdInsPs信号转导途径'>    1.3.2 DREPP参与Ca²⁺介导的PtdInsPs信号转导途径
•     1.3.3 DREPP调控植物生长发育
•     1.3.4 DREPP参与植物胁迫应答
•   1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株和载体
•     2.1.3 常用培养基的配制
•     2.1.4 常用试剂及溶液的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 植物材料的培养及处理
•     2.2.2 PutDREPP1和PutDREPP2基因获得及表达分析
•     2.2.3 PutDREPP1和PutDREPP2的亚细胞定位
• 2+/CaM结合能力分析'>    2.2.4 PutDREPPs与Ca²⁺/CaM结合能力分析
•     2.2.5 PutDREPPs基因在拟南芥中的表达及抗性分析
• 3 结果与分析
•   3.1 PutDREPPs基因的克隆与表达特性分析
•     3.1.1 PutDREPP1和PutDREPP2基因的克隆
•     3.1.2 PutDREPP1和PutDREPP2基因的生物信息学分析
•     3.1.3 逆境下PutDREPP1和PutDREPP2基因表达特性分析
•     3.1.4 PutDREPP1和PutDREPP2基因表达特性分析
•   3.2 PutDREPPs的亚细胞定位
•     3.2.1 植物表达载体的构建及酶切鉴定
•     3.2.2 在烟草叶片中的亚细胞定位
•     3.2.3 在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
• 2+/CaM结合能力分析'>  3.3 PutDREPPs的Ca²⁺/CaM结合能力分析
•     3.3.1 原核表达载体的构建及鉴定
•     3.3.2 His-PutDREPP1和His-PutDREPP2蛋白的诱导
•     3.3.3 His-PutDREPP1和His-PutDREPP2蛋白纯化
•     3.3.4 PutDREPP1和PutDREPP2蛋白免疫印迹验证
• 2+/CaM的相互作用'>    3.3.5 PutDREPP1和PutDREPP2与Ca²⁺/CaM的相互作用
•   3.4 PutDREPPs基因在拟南芥中的表达和抗性分析
•     3.4.1 植物表达载体的构建及酶切鉴定
• 1代植株检测'>    3.4.2 转基因拟南芥T₁代植株检测
• 2代植株RT-PCR检测'>    3.4.3 转基因拟南芥T₂代植株RT-PCR检测
•     3.4.4 转PutDREPP1基因拟南芥的抗逆性分析
• 4 讨论
•   4.1 PutDREPP1和PutDREPP2具有DREPP家族蛋白特征
• 2+/CaM结合能力'>  4.2 PutDREPP1和PutDREPP2具有Ca²⁺/CaM结合能力
•   4.3 PutDREPP1和PutDREPP2参与植物逆境应答
•   4.4 PutDREPP1在植物盐应答中起重要作用
• 5 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张洵

导师: 戴绍军

关键词: 星星草,逆境胁迫,功能

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北林业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000278

总页数: 65

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