粉尘螨酸性核糖体P2蛋白的原核表达，免疫原性鉴定及致敏机制研究

论文摘要

背景:近年来,过敏性疾病的发病率不断上升。过敏性疾病又分为过敏性哮喘、过敏性皮炎、鼻炎等。而过敏性哮喘多是由室内吸入性过敏原引起的,最常见的室内吸入性过敏原为尘螨,尤其粉尘螨及屋尘螨最常见。目前,已经陆续用分子生物学手段从尘螨里面克隆表达出了多种变应原蛋白,其中粉尘螨酸性核糖体P2蛋白（ALT）是新发现的尘螨过敏原。在本研究中,我们利用大肠杆菌原核表达系统克隆表达出粉尘螨酸性核糖体P2蛋白,并通过亲和层析得到了较高纯度的重组ALT蛋白,并鉴定其免疫原性,后又通过动物实验建立小鼠模型来证实了重组酸性核糖体P2蛋白是一种新型过敏原,并通过细胞实验探讨了ALT的致敏机理。目的:克隆表达粉尘螨ALT蛋白,并鉴定其免疫原性以及致敏机理。方法:（1）通过基因工程技术合成粉尘螨过敏原ALT基因,并与pET-32a载体连接后转入大肠埃希菌E.coli BL21诱导表达,通过亲和层析纯化得到重组蛋白;（2）间接酶联免疫吸附实验（ELISA）、临床的皮肤点刺测试（SPT）检测重组蛋白ALT的免疫原性;（3）动物模型证实重组ALT蛋白的致敏性;（4）细胞及动物实验探讨ALT蛋白的致敏机理。结果:（1）SDS-PAGE结果显示重组ALT蛋白分子量约27kDa;（2）临床皮肤点刺实验表明:20尘螨过敏患者中有3例对重组ALT过敏,阳性率15%;ELISA结果显示重组蛋白ALT能与尘螨过敏患者血清IgE抗体特异性结合,阳性率为20%,为尘螨次要过敏原,此过敏原正在申请命名中;（3）动物实验结果显示重组ALT蛋白能使小鼠产生过敏性哮喘症状,使机体Th1/Th2失衡,IL-4、IL-13等Th2型细胞因子升高,导致过敏;（4）体外细胞实验ALT能够激活PI3K/Akt通路诱导IL-13表达的升高,从而上调JAK-1的表达并导致STAT-6的磷酸化,其诱导Th2调节因子GATA-3和Th2特征性细胞因子的表达,造成Th1/Th2的失衡,从而导致过敏。结论:克隆,表达,纯化了具有过敏原性的粉尘螨重组蛋白ALT,并结合体内体外实验证实了重组ALT的致敏性,表明ALT是一种新的尘螨次要过敏原。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 尘螨与过敏性哮喘
•   1.2 尘螨过敏性疾病发病机制及治疗
•   1.3 酸性核糖体P2蛋白
• 第2章 粉尘螨重组酸性核糖体P2蛋白的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
•   2.1 实验材料与方法
•     2.1.1 实验主要材料
•     2.1.2 实验主要仪器
•     2.1.3 主要实验耗材及试剂
•     2.1.4 主要实验试剂的配制
•     2.1.5 实验方法
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 粉尘螨ALT基因的扩增
•     2.2.2 表达载体p ET32a-ALT的双酶切鉴定
•     2.2.3 粉尘螨ALT的大量表达、纯化
•     2.2.4 r-ALT与尘螨过敏患者血清酶联吸附实验
•     2.2.5 r-ALT临床皮肤点刺实验（Skin prick test）
•     2.2.6 ALT与其物种酸性核糖体P2 蛋白的序列比对
•     2.2.7 ALT与其物种酸性核糖体P2 蛋白的分子进化树
•   2.3 讨论
• 第3章 ALT过敏性哮喘小鼠模型的构建
•   3.1 实验的材料与方法
•     3.1.1 实验主要材料
•     3.1.2 实验主要仪器
•     3.1.3 主要实验耗材及试剂
•     3.1.4 主要实验试剂的配制
•     3.1.5 ALT哮喘模型的构建
•     3.1.6 实验数据的统计分析
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 实验小鼠气道高反应性（AHR）检测
•     3.2.2 小鼠血清IgG1、IgE的测定
•     3.2.3 小鼠脾细胞培养上清及肺泡灌洗液中IL-4,IL-13 及IFN-γ的测定
•     3.2.4 流式检测小鼠脾细胞胞内IL-4,IL-13及IFN-γ的表达
•     3.2.5 小鼠肺组织HE染色
•   3.3 讨论
• 第4章 粉尘螨ALT致敏哮喘机制的研究
•   4.1 实验的材料与方法
•     4.1.1 实验主要材料
•     4.1.2 实验主要仪器
•     4.1.3 主要实验耗材及试剂
•     4.1.4 主要实验试剂的配制
•     4.1.5 小鼠肺组织提取蛋白
•     4.1.6 免疫印迹检测小鼠肺组织JAK/STAT6 信号通路的表达
•     4.1.7 肺组织糖原PAS染色
•     4.1.8 r-ALT刺激原代成熟的A549 细胞,免疫印迹检测AKT信号通路
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 ALT通过上调IL-13 激活JAK1/ STAT6 通路
•     4.2.2 ALT刺激粘液过量产生和肺功能损害
•     4.2.3 ALT通过PI3K/ Akt途径诱导IL-13 表达
•   4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果
•   （一）论文发表情况
•   （二）参与的科研项目

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 江贝

导师: 刘志刚

关键词: 酸性核糖体蛋白,粉尘螨,原核表达

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 深圳大学

分类号: R384.4

总页数: 50

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