H5N1和H1N1亚型流感病毒致病差异机制探索研究

论文摘要

甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是人群当中季节性流感流行和偶发的大流行的主要病原体,拥有广泛的宿主范围和变异程度,能够感染种类繁多的鸟类和哺乳动物,给人类社会带来严重危害。甲型流感病毒（IAV）是正黏科病毒（Orthomyxoviridae）,基因组由八条单义负链RNA组成,编码包括核蛋白（Nucleoprotein,NP）、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）、血凝素（Hemagglutinin,HA）在内的十多种蛋白。根据其表面糖蛋白HA和NA的抗原特异性,甲型流感病毒可以进一步分成多种亚型。甲型流感病毒的不同亚型在感染人体后引起不同的致病表现型。当病毒入侵宿主后,病毒蛋白会和宿主蛋白相互作用操纵宿主信号通路以利于自身复制和生存。在宿主众多的信号通路中,NF-κB信号通路是比较重要的抗病毒信号通路。当病原微生物入侵人体时,病原微生物的毒力蛋白或者遗传物质充当配体与细胞表面的受体相结合,通过一系列的接头蛋白将信号传递给IKK复合物,被活化的IKK复合物会激活IκB,使IκB泛素化降解,然后与核因子κB解离。核因子进入细胞核,结合相关基因,促进基因转录,使宿主细胞表达出抗病毒的细胞因子,以此实现抗病毒的效果。NF-κB信号通路存在于几乎所有的动物细胞中,是信号通路研究领域的热点问题。病毒蛋白和宿主蛋白之间的直接相互作用为流感病毒入侵宿主引起复杂的病理状况提供了基础。甲型流感病毒的不同亚型在感染人体后引起不同的致病表现型是因为不同亚型的流感病毒与宿主信号通路的关系不同,即不同流感病毒的不同蛋白和人体信号通路相互作用产生不同的生理效应。我们设计实验来探索流感病毒蛋白和NF-κB信号通路关系以及相互作用位点的差异来验证我们的猜想。在我们的实验中,我们选取了H5N1和H1N1亚型流感病毒的两组蛋白神经氨酸酶NA和核蛋白NP,通过双荧光素酶报告基因实验确定病毒蛋白和NF-κB信号通路的关系以及病毒蛋白影响NF-κB信号通路的可能位点,随后我们利用免疫共沉淀实验确定病毒蛋白影响NF-κB信号通路的具体位点。具体实验结果如下:1、H5N1和H1N1亚型流感病毒的NP蛋白和NF-κB信号通路的关系存在差异H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路,作用位点在TAK1与IKKα处。H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制TN F-α介导的NF-κB-1uc转录活性;免疫印迹实验结果显示H5N1亚型流感病毒的NP蛋白增加IκBα的蛋白表达水平,抑制IκBα的磷酸化;免疫荧光实验显示H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制p65蛋白入核,以上结果说明H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路。H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制TAK复合物和IKKα蛋白介导的NF-κB-1uc转录活性,与TAK1以及IKKα 具有相互作用且抑制IKKα的磷酸化,说明H15N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路的作用位点在TAK1与IKKα处。H1N1亚型流感病毒的NP蛋白对NF-κB信号通路没有影响。H1N1亚型流感病毒的NP蛋白不影响TNF-α介导的NF-κB-Iuc转录活性,对IκBα的蛋白表达水平和IκBα的磷酸化以及p65蛋白的核转位没有影响说明H1N1亚型流感病毒的NP蛋白对NF-κB信号通路没有影响。2、H5N1和H1N1亚型流感病毒的NA蛋白和NF-κB信号通路的关系也存在差异H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB 号通路,作用位点在TAB2处。H5N1亚型流感病毒的NA蛋白上调IL-1β介导的NF-κB-1uc转录活性,说明H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信号通路。H5N1亚型流感病毒的NA蛋白增强TAK复合物介导的NF-κB-Iuc转录活性,与TAB2蛋白具有直接相互作用,说明H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信号通路的作用位点在TAB2处。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路,作用位点在IKKβ处。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制IL-1β介导的NF-κB-Iuc转录活性说明H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制TAB2和IKKβ介导的NF-κB-Iuc转录活性,与IKKβ具有直接相互作用,说明H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路的作用位点在IKKβ处。结果一和结果二的对比,验证了我们的猜想不同流感病毒的不同蛋白和人体信号通路相互作用产生不同的生理效应,即流感病毒和宿主蛋白相互作用具有亚型特异性特征,其可响应不同亚型的流感病毒的特定致病机制。对实验结果的分析也表明流感病毒的不同亚型可以影响NF-κB信号通路是否抗病毒以及抗病毒的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 流感病毒简介
•     1.1.1 流感病毒蛋白的结构和功能
•     1.1.2 流感病毒生命周期
•     1.1.3 流感病毒的分类
•   1.2 NF-κB信号通路简介
•     1.2.1 NF-κB信号通路的组成
•     1.2.2 NF-κB信号通路分类
•     1.2.3 病原微生物与NF-κB信号通路的关系
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞及细胞培养所用试剂与耗材
•     2.1.2 质粒载体、工具酶及菌株
•     2.1.3 免疫共沉淀和免疫印记实验所需材料和抗体
•     2.1.4 实验设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 引物合成、质粒构建和测序
•     2.2.2 细胞培养、冻存和复苏
•     2.2.3 真核细胞的转染
•     2.2.4 双荧光素酶报告基因系统实验
•     2.2.5 免疫共沉淀实验
•     2.2.6 免疫印迹实验
• 第三章 结果
•   3.1 H5N1和H1N1 NP蛋白对TNF-α介导的NF-κB信号通路活性影响不同
•     3.1.1 H5N1 NP蛋白抑制TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活
•     3.1.2 H5N1 NP蛋白潜在靶标为TAK复合物与IKKα
•     3.1.3 H5N1 NP蛋白靶定于TAK1和IKKα处
•     3.1.4 H5N1 NP蛋白抑制IKKα的磷酸化
•     3.1.5 H1N1 NP蛋白不影响TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活
•   3.2 H5N1和H1N1 NA蛋白对IL-1β介导的NF-κB信号通路活性影响不同
•     3.2.1 H5N1 NA蛋白促进IL-1β介导的NF-κB信号通路的激活
•     3.2.2 H5N1 NA蛋白潜在靶标为TAK复合物
•     3.2.3 H5N1 NA蛋白靶定于TAB2处
•     3.2.4 H1N1 NA蛋白抑制1L-1β介导的NF-κB信号通路的激活
•     3.2.5 H1N1 NA蛋白潜在靶标为TAB2和IKKβ
•     3.2.6 H1N1 NA蛋白靶定于IKKβ处
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王玉洁

导师: 梁龙

关键词: 流感病毒,神经氨酸酶,核蛋白,信号通路,相互作用

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 安徽大学

分类号: R373.13

总页数: 59

文件大小: 3627K

下载量: 118