苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的去除方法论文和设计-欧阳子均

全文摘要

本发明提供一种利用阴离子交换层析去除苏金单抗制品中半胱氨酸化异构体的方法，该方法包括使所述苏金单抗制品经受阴离子交换层析，其中所述苏金单抗制品包含哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗。本发明的方法可以有效去除半胱氨酸化异构体，并且工艺简单稳定，重复性好，并且不会破坏抗体的正常结构；与现有技术产品相比，苏金单抗的质量也得到提高。

主设计要求

1.一种用于去除苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的方法，所述方法包括，使所述苏金单抗制品经受阴离子交换层析，其中，所述苏金单抗制品包含哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗，所述方法包括：1)以复合型阴离子交换层析填料装柱，使用5-50mMTris-HCl缓冲液，pH8.9平衡层析柱至基线平，其中所述复合型阴离子交换层析填料为CaptoTMadhereImpRes填料或BestaroseDiamondMMA填料；2)将含所述苏金单抗的上样液调pH值至8.5±0.1，上样，使用5-50mMTris-HCl缓冲液，pH8.9平衡所述层析柱至基线平，所述上样液为重组产生苏金单抗的哺乳动物细胞的培养上清液，或者为所述培养上清液的经纯化部分；3)以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为5-50mMTris-HCl缓冲液，pH8.9，流动相B为10-100mMTris-HCl缓冲液，pH7.1，线性梯度洗脱包括：70-0%的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱至少20个柱体积（CV），其中100%的流动相B洗脱至少8个CV，通过监测A280处的吸光度在蛋白出峰后收集洗脱级分；并且，分别控制步骤2)中所述上样液和步骤3)中所述流动相的流速，使得第一个洗脱峰的保留时间大于3分钟。

设计方案

1.一种用于去除苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的方法，所述方法包括，使所述苏 金单抗制品经受阴离子交换层析，其中，所述苏金单抗制品包含哺乳动物细胞重组产生的 苏金单抗，所述方法包括：

1) 以复合型阴离子交换层析填料装柱，使用5-50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡层 析柱至基线平，其中所述复合型阴离子交换层析填料为Capto ^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料或 Bestarose Diamond MMA填料；}

2) 将含所述苏金单抗的上样液调pH值至8.5±0.1，上样，使用5-50 mM Tris-HCl缓冲 液，pH 8.9平衡所述层析柱至基线平，所述上样液为重组产生苏金单抗的哺乳动物细胞的 培养上清液，或者为所述培养上清液的经纯化部分；

3) 以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为5-50 mM Tris-HCl缓冲 液，pH 8.9，流动相B为10-100 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1，线性梯度洗脱包括：70-0%的流 动相A和30%-100%的流动相B洗脱至少20个柱体积（CV），其中100%的流动相B洗脱至少8个 CV，通过监测A280处的吸光度在蛋白出峰后收集洗脱级分；

并且，分别控制步骤2)中所述上样液和步骤3)中所述流动相的流速，使得第一个洗脱 峰的保留时间大于3分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述Tris-HCl缓冲液为25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，上样量为不高于60 mg所述苏 金单抗\/mL所述填料。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，上样量为不高于50 mg所述苏 金单抗\/mL所述填料。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，使用步骤1)中的Tris-HCl缓 冲液平衡所述层析柱至基线平。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述流动相A为25 mM Tris- HCl缓冲液，pH 8.9，所述流动相B为50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述线性梯度洗脱包括：以 70-0%的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱20个CV，其中100%的流动相B洗脱8个CV。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1) 以Capto ^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料或Bestarose Diamond MMA填料装柱，使用25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡层析柱至基线平；}

2) 将含所述苏金单抗的上样液调pH 8.5±0.1，以不高于60 mg所述苏金单抗\/mL所述 Capto ^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料或不高于50 mg所述苏金单抗\/mL所述Bestarose Diamond MMA 填料上样，再次使用25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡所述层析柱至基线平；}

3) 以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为25 mM Tris-HCl缓冲液， pH 8.9，流动相B为50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1，以70-0%的流动相A和30%-100%的流动 相B洗脱20个CV，其中100%的流动相B洗脱8个CV，期间监测A280处的吸光度，在蛋白出峰后， 当A280处的吸光度大于100mAu开始收集洗脱级分，小于100mAu停止收集。

9.一种苏金单抗的制备方法，所述制备方法包括，使哺乳动物细胞表达苏金单抗，收获 细胞培养上清液并可选地进行细胞培养上清液的纯化，然后使所述细胞培养上清液或其经 纯化部分经受权利要求1至8中任一项所述的方法。

设计说明书

技术领域

本发明涉及抗体制品纯化技术领域，具体而言，本发明涉及苏金单抗或其制品中 半胱氨酸化变异体的去除方法。

背景技术

白细胞介素（IL-17）单抗是一种与IL-17结合的单克隆抗体，苏金单抗（AIN457）作 为IL-17单抗中的一种，已被批准用于银屑病和强直性脊柱炎等疾病的治疗，具有明显的治 疗效果与应用前景。

然而，苏金单抗在轻链可变区的第97位存在游离半胱氨酸，该游离半胱氨酸上的 游离巯基化学性质非常活跃，能与大量的物质发生化学反应，例如与培养体系中存在的半 胱氨酸反应（即半胱氨酸化修饰），由此形成苏金单抗的半胱氨酸化变异体，造成抗体活性 损失。

中国专利申请公开CN107001460A提出了一种选择性还原苏金单抗的这一半胱氨 酸化变异体的方法，该方法采用还原剂来还原被掩蔽的半胱氨酸残基，以保持最大的苏金 单抗抗原结合活性。该专利申请优选半胱氨酸作为还原剂，通过加入一定摩尔比的半胱氨 酸，并且调节反应过程中的溶氧、pH和温度，在反应一段时间后再通过调节反应体系的pH等 方式终止反应，获得完整的抗体。

但是，该专利申请的方法在应用到商业化生产时有着显著的缺陷。相较于经典的 单克隆抗体纯化方法，该方法多了一个氧化还原孵育的步骤，这一步骤需要严格控制条件， 因此增加了工艺的复杂性，也不利于大规模生产。此外所加入的半胱氨酸不仅能还原抗体 的半胱氨酸化变异体，也会破坏抗体的正常二硫键，有可能导致抗体碎片产生，降低抗体的 纯度和活性，增加工艺风险。此外，这一步骤所需要的非常规抗体纯化设备、试剂、耗材也大 大增加了工艺的成本。

因此，对于苏金单抗或其制品中的半胱氨酸化变异体，本领域仍然存在对其去除 方法的需要。

发明内容

针对现有技术的不足，解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种利用阴离 子交换层析技术去除苏金单抗的半胱氨酸化变异体的方法，该方法利用苏金单抗与其半胱 氨酸化变异体在理化性质上的天然差异，分离去除该半胱氨酸化变异体。该方法非通过化 学反应的方式来改变抗体的结构，因此不会破坏抗体的正常结构，工艺简单稳定，重复性 好。

如本文所用，本发明的苏金单抗（secukinumab）在轻链互补决定区CDR3中顺-脯氨 酸后存在游离半胱氨酸，对应于轻链可变区，该游离半胱氨酸位于第97位。例如，诺华公司 生产的AIN457。

如本文所用，本发明的苏金单抗的半胱氨酸化变异体是指，在正常单抗分子的该 游离半胱氨酸残基上的巯基，与另一个非单抗分子本身的游离半胱氨酸的巯基发生反应， 形成二硫键，最终生成的比正常单抗分子量+119Da或+238Da（取决于两个轻链上的游离半 胱氨酸残基是否都发生反应）的半胱氨酸化变异体。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种用于去除苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的方法，所 述方法包括，使所述苏金单抗制品经受阴离子交换层析。

其中，所述苏金单抗制品包含哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗；优选地，所述苏 金单抗制品为重组产生苏金单抗的哺乳动物细胞的培养上清液，或者为所述培养上清液的 经纯化部分。

其中，所述阴离子交换层析采用复合型阴离子交换层析填料进行；优选地，所述阴 离子交换层析采用流动相A和流动相B的线性梯度洗脱，其中流动相A为5-50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 8.9，流动相B为10-100 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1，线性梯度洗脱包括：70-0% 的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱至少20个柱体积（CV），其中100%的流动相B洗脱至少8 个CV。

具体地，所述方法包括以下步骤：

1) 以阴离子交换层析填料装柱，使用5-50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡层析 柱至基线平；

2) 将含所述苏金单抗的上样液调pH值至8.5±0.1，上样，使用5-50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 8.9平衡所述层析柱至基线平；

3) 以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为5-50 mM Tris-HCl缓 冲液，pH 8.9，流动相B为10-100 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1，通过监测A280处的吸光度在 蛋白出峰后收集洗脱级分。

在本发明方法的步骤1)中，优选地，所述阴离子交换层析填料为复合型阴离子交 换层析填料，例如GE公司的Capto ^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料、GE的adhere、博格隆MMA。根据本发 明的具体实施方式，可选用GE公司的Capto TM<\/sup> adhere ImpRes填料或博格隆公司的 Bestarose Diamond MMA填料；其余任意复合型阴离子交换层析填料均能达到相同的实验 效果。}

优选地，所述Tris-HCl缓冲液为25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9。

在本发明方法的步骤2)中，优选地，所述上样液包含由哺乳动物细胞重组产生的 苏金单抗或其制品。例如，所述上样液为重组产生苏金单抗的哺乳动物细胞的培养上清液， 或者为所述培养上清液的经纯化部分。根据本发明的具体实施方式，所述上样液通过包括 以下步骤的方法获得：使哺乳动物细胞表达苏金单抗，收获细胞培养上清液，Protein A亲 和层析纯化。

优选地，上样量为不高于60 mg或不高于50 mg所述苏金单抗\/mL所述填料。

优选地，使用步骤1)中的Tris-HCl缓冲液平衡所述层析柱至基线平。

在本发明方法的步骤3)中，优选地，所述流动相A为25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9，所述流动相B为50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1。

优选地，所述线性梯度洗脱包括：以70-0%的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱20 个CV，其中100%的流动相B洗脱8个CV。

优选地，在本发明的方法中，分别控制步骤2)中上样液和步骤3)中流动相的流速， 使得第一个洗脱峰的保留时间大于3分钟。

根据本发明的具体实施方式，所述方法包括：

1) 以Capto ^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料或Bestarose Diamond MMA填料装柱，使用25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡层析柱至基线平；}

2) 将含所述苏金单抗的上样液调pH 8.5±0.1，以不高于60 mg或不高于50 mg所 述苏金单抗\/mL所述填料上样，再次使用25 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.9平衡所述层析柱至 基线平；

3) 以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为25 mM Tris-HCl缓冲 液，pH 8.9，流动相B为50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.1，以70-0%的流动相A和30%-100%的流 动相B洗脱20个CV，其中100%的流动相B洗脱8个CV，期间监测A280处的吸光度，在蛋白出峰 后收集洗脱级分。

其中，分别控制步骤2)中上样液和步骤3)中流动相的流速，使得第一个洗脱峰的 保留时间大于3分钟。

另一方面，本发明提供一种苏金单抗的制备方法，所述方法包括：使哺乳动物细胞 表达苏金单抗，然后在收获细胞培养上清液并可选地进行细胞培养上清液的纯化后，使细 胞培养上清液或其经纯化部分进行本发明的用于去除苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体 的方法。

有文献证明，苏金单抗、特别是苏金单抗哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗制品 中的半胱氨酸化变异体在CEX电荷异质性图谱中表现为酸性变异体（Acidic Variant），可 以通过CEX电荷异质性图谱表征来分析其是否存在及其相对含量。因此，本发明的发明人通 过pH梯度CEX分析方法，对使用CN107001460A专利所述工艺氧化还原前后的苏金单抗实验 样品与苏金单抗原研药（诺华公司生产的Cosentyx ^{®<\/sup>）进行了头对头比对，确定了苏金单抗 半胱氨酸化变异体在pH梯度CEX图谱上的色谱峰归属。基于此，开发了本发明的苏金单抗制 品中半胱氨酸化变异体的去除方法。}

与现有技术相比，本发明的方法采用阴离子交换层析对苏金单抗或其制品进行纯 化，具体为去除苏金单抗的半胱氨酸化变异体。经过对Poros HS、Capto S ImpAct进行电导 梯度洗脱工艺的摸索，对Poros HS、Poros XS、Capto MMC ImpRes进行pH工艺的摸索，通过 检测苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体在pH梯度CEX图谱上的层析前后色谱峰变化情况， 证明了采用复合型阴离子交换层析填料进行阴离子交换层析，可以有效去除半胱氨酸化异 构体，甚至可完全去除。本发明的方法工艺简单稳定，重复性好，并且不会破坏抗体的正常 结构；与现有技术产品相比，苏金单抗的质量也得到提高。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了实施例1中参比制剂、Redox前后实验样品的CEX图谱。

图2显示了实施例2中参比制剂、层析前后实验样品的CEX图谱。

图3显示了实施例3中参比制剂、层析前后实验样品的CEX图谱。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例中使用的苏金单抗的实验样品为使用应用DNA重组技术构建的CHO（中国仓 鼠卵巢）细胞表达的苏金单抗。细胞培养流程为通常的单抗培养工艺，包括在摇瓶中扩增培 养，然后接种到2 L（实验样品1）或20 L（实验样品2）流加生物反应器中培养14天后收获的 细胞培养上清液，然后经过一步Protein A亲和层析纯化获得含苏金单抗的样品。

实施例1<\/u> 苏金单抗的半胱氨酸化变异体在pH梯度CEX图谱上的色谱峰的表征

使用专利申请公开文件CN107001460A中所述的氧化还原工艺（Redox）对实验样品 1进行选择性还原，获得Redox后的实验样品。

然后使用pH梯度CEX对Redox前后的实验样品进行分析，同时以苏金单抗的原研药 （购自诺华公司，Cosentyx ^{®<\/sup>，批号S0029）作为参比制剂，进行头对头比对分析。}

pH梯度CEX方法如下：

液相系统：Waters Acquity Arc

色谱柱：Thermo ProPac WCX-10 4×250mm

流动相A：4 mM Piperazine，4 mM Imidazole，4 mM Tris，pH 5.0

流动相B：4 mM Piperazine，4 mM Imidazole，4 mM Tris

流动相C：500 mM NaCl

柱温：40℃

流速：1.0 ml\/min

样品处理：以苏金单抗蛋白质量计，使用0.1×PBS将三种样品稀释至1 mg\/ml左 右，然后1:20的CpB酶：样品中蛋白质含量的比例（质量比）加入CpB酶，37℃孵育30分钟，然 后直接进样，进样量约50 μg。

以流动相A、流动相B和流动相C进行线性梯度洗脱，以55% ~ 0%的流动相A、43.6% ~ 96.8%的流动相B和1.4% ~ 3.2%的流动相C洗脱38分钟。

获得的CEX图谱示于图1。

由图1可见，Redox后实验样品的酸性峰（主峰左边的峰，箭头所指）色谱峰形和保 留时间与参比制剂一致。因此，可确认经Redox后，实验样品的半胱氨酸化变异体已经被还 原为正常的单抗分子。将Redox前后的实验样品的CEX图谱进行比较，确认了半胱氨酸化变 异体在该pH梯度CEX方法的色谱图上的色谱峰归属。

实施例2<\/u> 采用本发明方法的苏金单抗的半胱氨酸化变异体的去除

以Capto^{TM<\/sup> adhere ImpRes填料（购自GE公司）装柱，使用25 mM Tris-HCl，pH 8.9 平衡层析柱至基线平。}

将实验样品2调pH 8.5±0.1，以不高于60 mg抗体\/mL填料上样，再次使用25 mM Tris-HCl，pH 8.9平衡层析柱至基线平。

以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为25mM Tris-HCl，pH 8.9， 流动相B为50 mM Tris-HCl，pH 7.1，以70-0%的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱20个CV， 其中100%的流动相B洗脱8个CV，期间监测A280处的吸光度，当A280处的吸光度大于100mAu 开始收集洗脱级分，小于100mAu停止收集。获得层析后实验样品。

然后使用pH梯度CEX对层析前后的实验样品进行分析，同时以苏金单抗的原研药 （购自诺华公司，Cosentyx ^{®<\/sup>，批号S0029）作为参比制剂，进行头对头比对分析。}

pH梯度CEX方法以及样品处理等均参照实施例1所述进行。

结果见表1和图2。碱性峰为主峰右侧的峰。

表1. 参比制剂、实验样品与层析后实验样品的CEX结果

表1与图2的结果显示出，从图谱和数值上看，实验样品经过本发明的方法处理之 后，半胱氨酸化异构体被完全去除，且酸性峰的整体含量有十分显著的下降；从主峰含量来 看，经过本发明的方法处理过的样品质量也显著优于参比制剂。

实施例3<\/u> 采用本发明方法的苏金单抗的半胱氨酸化变异体的去除

以Bestarose Diamond MMA填料（购自博格隆公司）装柱，使用25 mM Tris-HCl，pH 8.9平衡层析柱至基线平。

将实验样品2调pH 8.5±0.1，以不高于50 mg抗体\/mL填料上样，再次使用25 mM Tris-HCl，pH 8.9平衡层析柱至基线平。

以流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中流动相A为25mM Tris-HCl，pH 8.9， 流动相B为50 mM Tris-HCl，pH 7.1，以70-0%的流动相A和30%-100%的流动相B洗脱20个CV， 其中100%的流动相B洗脱8个CV，期间监测A280处的吸光度，当A280处的吸光度大于100mAu 开始收集洗脱级分，小于100mAu停止收集。获得层析后实验样品。

然后使用pH梯度CEX对层析前后的实验样品进行分析，同时以苏金单抗的原研药 （购自诺华公司，Cosentyx ^{®<\/sup>，批号SJ280）作为参比制剂，进行头对头比对分析。}

pH梯度CEX方法以及样品处理等均参照实施例1所述进行。

结果见表2和图3。碱性峰为主峰右侧的峰。

表2. 参比制剂、实验样品与层析后实验样品的CEX结果

表2与图3的结果显示出，从图谱和数值上看，实验样品使用其他品牌的同类型复 合阴离子层析填料，其他条件与本发明的方法相同处理之后，半胱氨酸化异构体被完全去 除，且酸性峰的整体含量有十分显著的下降；并且，该结果与实施例2的结果无显著差异。

实施例4<\/u> 采用本发明方法得到的苏金单抗保留的活性以及其他原有性质的检测

参考实施例2所述对实验样品2进行本发明的层析方法。

然后，对层析后的实验样品2进行纯度与杂质、结构与修饰、抗原结合活性等关键 质量属性（CQA）的分析，同时以苏金单抗的原研药（购自诺华公司，Cosentyx ^{®<\/sup>，批号为S0029 和SJ280）作为参比制剂，进行比对分析。检测结果见表3。}

表3

由上表中的数据可知，层析后的实验样品的抗原结合活性、结构与修饰与参比制 剂一致，而纯度与杂质优于参比制剂。因此，可知层析后实验样品仍保留了其应有的纯度、 结构和活性。

实施例5<\/u> 相比于CN107001460A专利所述的氧化还原工艺优化的技术效果的检测。

按照实施例1所述，使用专利申请公开文件CN107001460A中所述的氧化还原工艺 （Redox）对实验样品1进行选择性还原，获得Redox后的实验样品1。

按照实施例2所述，使用本发明的方法对实验样品2进行层析处理，获得层析后的 实验样品2。

对Redox前后的实验样品1和层析前后的实验样品2进行CE-SDS非还原电泳分析， 同时以苏金单抗的原研药（购自诺华公司，Cosentyx ^{®<\/sup>，批号为S0029）作为参比制剂，进行比 对分析。检测结果见表4。}

表4

由表4的数据可知，使用CN107001460A专利所述的氧化还原工艺对实验样品1处理 后，实验样品1的低分子量杂质总量有显著的增加；而使用层析工艺对实验样品2处理后，实 验样品2的低分子量杂质总量较处理前，没有明显的变化。

由此可知，使用层析工艺处理样品，不会产生低分子量杂质，而该属性是单抗药物 的关键质量属性，因此这是本发明的层析工艺相对CN107001460A专利所述的氧化还原工艺 的一大优势。

此外，CN107001460A专利所述的氧化还原工艺相较于经典的单克隆抗体层析纯化 方法，操作更复杂，需要更严格地控制条件，并且还需要特殊的工艺设备，因此增加了工艺 的复杂性，提高了工艺成本，也不利于大规模生产。这也是本发明的层析工艺相对Redox的 另一大优势。

因此，本发明通过简单易行的方法去除了苏金单抗的半胱氨酸化变异体。相比现 有技术，本发明采用的层析方法降低了工艺的复杂性，节约了操作时间，并且能提升产品的 品质。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。

设计图